סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים
22 באוקטובר 2011
פעילות ספונטנית של פיתוח רשתות נוירונים ניתן למדוד באמצעות AM-אסתר צורות של סידן רגיש צבעים אינדיקטור. שינויים סידן תוך תאי, המציין ההפעלה העצבית, מזוהים כמו שינויים חולפות הקרינה אינדיקטור עם אחד או שני פוטונים הדמיה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאמים עבור מגוון של רשתות נוירונים התפתחותית תלויי במבחנה.
המטרה הכוללת של סרטון זה היא להדגים כיצד למדוד פעילות רשתית מנתחים של קליפת המוח בהתפתחותה באמצעות אינדיקטור פלואורסצנטי הרגיש לסידן. נתחי מוח DY מוכנים מקליפת המוח הפנימית המתפתחת של עכבר צעיר. הן נוירונים והן אסטרוציטים נטענים בסמנים התלויים בסידן.
שינויים בפלואורסצנציה של צבעים תלויי סידן משקפים שינויים בפעילות התאית. ניתן לצבוע תאים שאינם נוירונליים, כולל אסטרוציטים, מיקרוגליה ותאי אנדותל, באמצעות צבעי סמן ספציפיים. פעילות של רשת קורטקלית מוקלטת באמצעות דימיון רב-פוטוני בשיטת time-lapse; תאים מזוהים בתוך הרשת על ידי יצירת ערימת תמונות תלת-ממדית (3D stack) דרך אזור העניין.
ניתן לנתח שינויים בפלואורסצנציה תאית על פני תאים מרובים כדי לקרוא את הפעילות של הרשת הקורטיקלית המתפתחת. תבנית מאפיינת של פעילות במערכת העצבים המתפתחת היא פעילות רשתית סינכרונית ספונטנית. פעילות סינכרונית נצפתה באזורים נוירונליים מתפתחים רבים ושונים, כולל קורטקס של חוט שדרה שלם והכנות של תרביות נוירונים מפוזלים במהלך תקופות של פעילות ספונטנית, שבהם נוירונים עוברים דפולריזציה כדי להוציא פוטנציאלי פעולה בודדים או פרצים של פוטנציאלי פעולה המפעילים תעלות יונים רבות, כולל תעלות סידן תלויות-מתח המובילות להזרמת סידן.
פעילות מסונכרנת ברמה גבוהה נמדדה מרשתות מקומיות באמצעות אלקטרודות שדה או מערכי רב-אלקטרודות. אלו מאפשרים קצבי דגימה זמניים גבוהים, אך מספקים רזולוציה מרחבית נמוכה יותר בשל הקריאה המשולבת של פעילות התאים. רזולוציה של תא בודד של פעילות עצבית אפשרית באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של patch clamp של נוירונים בודדים למדידת קצבי פריקה.
עם זאת, היכולת למדוד מרשת מוגבלת למספר הנוירונים שנמצאים ב-patch בו-זמנית, ובדרך כלל מדובר בנוירון אחד או שניים בלבד. השימוש בצבעי סמן פלואורסצנטיים תלויי סידן אפשר את מדידת פעילות מסונכרנת על פני רשת של תאים. טכניקה זו מעניקה הן רזולוציה מרחבית גבוהה והן דגימה זמנית מספקת כדי להקליט פעילות ספונטנית של הרשת המתפתחת.
אינדיקטורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן, כגון URA 2:00 AM ester, מכילים קבוצות חומצה קרבוקסית המסוגלות לקשור יוני סידן. צבעים פלואורסצנטיים אלו מופעלים על ידי אורכי גל ספציפיים של אור, באמצעות מיקרוסקופיית פוטון בודד או מיקרוסקופיית שני פוטונים. מספר הפוטונים הנפלטים מהצבע משתנה באופן זמני בעת קישור של סידן.
שינוי זה במספר הפוטונים או בפלואורסצנציה מדווח כאות ה-delta FF ומת corresponds לשינוי ברמת הסידן בתוך הנוירון. מדידה של שינויים באינדיקטורים הרגישים לסידן היא מדד קריאה שימושי של דפוסי פעילות רשת בתאים מתפתחים. שלום, אני ריאנה מורטי, ושמי ג'ולי אבוטס.
אנו מהמחלקה לנוירופיזיולוגיה פרשנית מהאוניברסיטה באמסטרדם. השתמשנו בדימות סידן כדי לחקור פעילות תפקודית ברקמה מתפתחת בקליפת המוח של עכבר, באמצעות אינדיקטורים רגישים לסידן בדימות מולטפוקאלי. מטרתו של סרטון קצר זה היא להדגים כיצד ניתן להשתמש בשיטות אלו כדי למדוד דפוסי פעילות ספונטניים ומעוררים ברשתות מתפתחות במערכת העצבים.
הוצא את המוח במהירות מגולגולתו של עכבר צעיר כדי לצמצם את הנזק למעגלים העצביים. בצע דיסקציה של המוח בתוך תמיסת פרוסות קרה (קרח). תמיסת הפרוסות מכילה coline chloride במקום הנתרן המשמש בדרך כלל ב-A TSF להקלטות עצביות.
בניסויים אלו, אנו מכינים פרוסות מוח מהקליפה האנטרלית (enteral cortex) של מוח עכבר בשלבי התפתחות. הניחו פיסת נייר סינון על פלטת פטרי והרטיבו אותה בכמה מיליליטרים של A TSF. העבירו את המוח אל פיסת נייר הסינון.
חצאי את ההמיספרים באמצעות להב תער בעל קצה יחיד. הפריד בין שני ההמיספרים. החזר את אחד מהם לתוך תמיסת הפריסה הקרה יחד עם ההמיספר הנותר.
הסר את המוח הקטן (cerebellum) באמצעות להב תער. הפוך המיספרה אחת על קו האמצע שלה, ובצע חיתוך של כ-1 millimeter מהפני השגב (dorsal surface) בזווית קלה של הלהב לכיוון הקצה הרוסטרלי (rostral end). הפוך את המוח על.
נקה את פני השטח שנגזרו לאחרונה באמצעות מקל צמר ושפכטל מתכת. העבר את המוח לבלוק החיתוך המתכתי. דחף בעדינות את המוח מהשפכטל באמצעות מקל צמר אל על המשטח המודבק.
פרוסות מוח בעובי 300 Micrometer נחתכות; עבור רקמה צעירה, מהירויות החיתוך ותדירות הלהב הן בדרך כלל נמוכות יותר מאלו המשמשות לרקמה בוגרת יותר. לאחר החיתוך, העבר כל פרוסה באמצעות פיפטת זכוכית; הפרוסות מועברות לתא ההחזקה, המכיל A TSF מחומצן בטמפרטורת החדר. ה-A CSF מכיל יחס גבוה יותר של מגנזיום לסידן מאשר תמיסת ה-A CSF.
הפרוסות המשמשות להקלטה נשארות למשך שעה אחת כדי להתאושש. כדי להעמיס לתאים אינדיקטור תלוי סידן או סמן ספציפי לתאים, יש להעביר את הפרוסות לתא לצורך הליך הצביעה. למרות שקיימים תאים מסחריים, ניתן להרכיב תא בקלות מציוד מעבדה סטנדרטי בעלות נמוכה מאוד.
כדי להכין תא צביעה, תזדקקו לציוד מעבדה בסיסי הכולל שתי צלחות פטרי מפלסטיק, מזרק אחד של 10 milliliter, קטע של צינור סיליקה, תבנית להכנסת תרבית תאים בעלת ממברנה חדירה למחצה, דבק מהיר, שלושה מחברי צינורות קטנים ומחט דקה. קחו את צלחת הפטרי הגדולה וצרו חור קטן בדופן הצד באמצעות מוט מחומם. קחו את צלחת הפטרי הקטנה וצרו חור בעל קוטר דומה, שיהיה גדול מספיק כדי שצינור הסיליקון יוכל לעבור דרכו.
העבירו קטע של צינור סיליקון דרך החור וצרו לולאה בתוך הצלחת הקטנה. השתמשו בדבק מהיר (super glue) כדי לאטום את הקצה הפתוח של הצינור. לאחר מכן, הדביקו את שאר הצינור לדופן הפנימית של צלחת הפטרי הקטנה.
הניחו את פטריית השגב הקטנה במרכז הפטריה הגדולה והדביקו אותה במקומה. קחו את הקצה הנותר של צינור הסיליקון והעבירו אותו דרך החור הקטן בדופן פטריית השגב. השתמשו במחט עדינה כדי ליצור חורים קטנים בצינור הסיליקון בתוך פטריית השגב.
בצעו את החורים במרווחי זמן שווים כדי להבטיח היתוך gasper אחיד. קחו באר לתרבית תאים עם ממברנה חדירה למחצה והשתמשו בסכין מנתחים מחוממת. חתכו את הסנטימטר העליון של הבאר כדי להשאיר צלחת רדודה להחזקת הפרוסות במהלך הדגירה.
הניחו את הצלחת הרדודה במרכז הצלחת הקטנה, כך שתהיה מוקפת בצינורית הסיליקון נקבובית. צרו חור בקוטר של כחצי עד סנטימטר אחד במכסה של הצלחת הגדולה. קחו מזרק פלסטיק של 10 milliliter באמצעות סקלפל מחומם.
בצעו חיתוך אלכסוני כדי להסיר את קצה המזרק. מרחו דבק מהיר (super glue) על פני השטח החתוכים של צינור המזרק. הדביקו זאת ישירות מעל החור במכסה של צלחת הפטרי הגדולה.
חבר מחבר צינורית לקצה קצה המזרק. הנח את הצלחת הרדודה במרכז צלחת הפטרי הקטנה, תוך וידוא שצינורית הגז נקבובית מונחת מסביב לצלחת. צינורית זו מחוברת לאחר מכן לאספקת גז קרבוגן להחמצת החתכים בחמצן.
במהלך האינקובציה, החזיר את המכסה של הצלחת הגדולה, המחוברת היא גם באופן ישיר לאספקת הגז באמצעות קצה המזרק. פעולה זו תבטיח אספקה של פחמן וגז מעל הפרוסות במהלך האינקובציה כדי למנוע דהייה של הצבע. כל הפרוצדורות מבוצעות בתנאי תאורה מינימליים ככל האפשר, והן הצבע והן הפרוסות נשמרים בחושך.
מלאו את תא הצביעה בכ-1.5 milliliters של A TSF מתוך מחזיק הפרוסות. הכניסו את תא הממשק פנימה ומלאו אותו ב-1 milliliter נוסף של A TSF. חשוב לשמור על אספקת חמצן טובה כדי לשמור על בריאות הרקמה ולהבטיח טעינה טובה של הפרוסה.
הצביעה מתבצעת בטמפרטורה של כ-35 °C כדי להקל על ספיגת הצבע לתאי העצב בזמן שתא הצביעה מתחמם. הכין את צבע האינדיקטור עבור fira 2:00 AM Ester. הוסף 9 µL של DMSO עם 1 µL של onic acid לבקבוקון של 50 µg.
DMSO וחומצה אולאית. משמשים כחומרי חדירה (permeation agents) המאפשרים לצבע להיספג דרך ממברנת הליפידים. ערבבו את הבקבוק במערבל Vortex למשך 15 דקות כדי להבטיח שהצבע התמוסס לחלוטין.
לצורך צביעה, העבירו כל פרוסה לממשק. הכניסו לתא הצביעה. טפטפו את הצבע ישירות על האזור הרלוונטי מעל הפרוסות, וסגרו את מכסה תא הצביעה.
השאירו את הפרוסות לדגירה בחושך למשך 20 עד 40 דקות, בהתאם לגיל העכבר שבו נעשה שימוש. לאחר הדגירה, העבירו את הפרוסות בחזרה למחזיק הפרוסות כדי לשטוף שאריות של צבע עודף. ניתן להתאים את פרוטוקולי הצביעה עבור דימוי סידן גם לרקמות מבוגרות יותר.
שלב זה דורש דגירה מקדימה נוספת. העבירו את הפרוסות הישנות לכלי דגירה מקדימה רדוד המכיל 3 mL של CSF ושמונה µL של תמיסת crema four בריכוז 0.5%. חממו ל-35 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לממשק (interface), הכניסו לתא הצביעה ופעלו לפי נהלי הצביעה הרגילים.
ניתן לצבוע פרוסות אלו גם עבור תאים שאינם נוירונליים, דהיינו אסטרוציטים, מיקרוגליה ותאים אנדותלליים. ניתן להשתמש ב-Sulfur rumine 1 0 1 כדי לצבוע אסטרוציטים עבור sulfur domine. הכינו תמיסה בריכוז 10 µM וטפטפו את הצבע הסגול על האזור הרלוונטי בפרוסות.
השאירו לדגירה למשך 15 דקות. העבירו את הפרוסות חזרה לתא ההחזקה כדי להסיר שאריות צבע עודפות. הצמיד FSE של לקטין עגבנייה יכול לצבוע מיקרוגליה ותאים אנדותליאליים.
עבור לקטין עגבנייה, הכין תמיסה בריכוז של 20 micrograms per milliliter. טפטף את הצבע על אזור העניין בתוך הפרוסות. השאר את הפרוסות להדגרה למשך 45 דקות.
לאחר מכן, העבירו את הפרוסות בחזרה לתא ההמתנה. במהלך ההדמיה, הפרוסות חייבות להיות יציבות תחת המיקרוסקופ. בדרך כלל מניחים נבל מתכת (metal harp) כדי להחזיק את הרקמה, אולם הוא עלול לעוות את פני השטח של הפרוסה באופן לא אחיד, מה שיוביל לשטח ראייה מוגבל שנמצא בפוקוס להדמיה, דבר שיש להימנע ממנו.
פרוסות אלו נצמדות לתא ההקלטה באמצעות פוליאתילן או תמיסת PEI. PEI הוא פולימר המשמש לשיפור היצמדות תאים למשטח למשך שעה אחת לפחות. לפני הנחת הפרוסות בתאי ההקלטה, מלאו תאים אלו בכמה מיליליטרים של תמיסת PEI כדי לכסות את רצפת התא.
ראשית, שטפו את ה-PEI מהתא באמצעות מים מזוקקים, ולאחר מכן תמיסת CSF. העבירו פרוסה לתא ההקלטה והסירו עודפי תמיסת A CSF. מקמו את הפרוסה במרכז התא בעזרת מכחול עדין.
הסרו את כל שארית ה-A CSF באמצעות פיסות קטנות של נייר סינון סופג. הקפידו לוודא שאין עוד A CSF סביב קצוות הפרוסה. לבסוף, טפטפו בעדינות 0.5 mL של A CSF על הפרוסה מבלי לשחרר אותה מהתא.
הנח את התאים בתוך מכל ממשק גדול ומאוורר בחמצן והשאר אותם למשך שעה אחת נוספת בחשיכה. ניתן לתעד שינויים בצבעי אינדיקטור רגישים לסידן באמצעות מיקרוסקופיית פוטון אחד או שני פוטונים. אנו משתמשים בלייזר טיטניום-ספיר coupled למיקרוסקופ Olympus כדי לאפשר דימוי של שני פוטונים ברשתות הנוירונליות שלנו.
בנוסף, אנו משתמשים במערכת trim scope של L Vision biotech עם מצלמת EM CCD hammer MATSU להגדלת קצבי סריקת הפריימים. מקמו את תא הפרוסות מתחת למיקרוסקופ עם זרימה יציבה של A-T-S-F מחומצן המכיל 1.6 millimolar סידן ו-1.5 millimolar מגנזיום, המוחמם בערך ל-30 °C בהתקנה באמצעות אור לבן.
אתר את אזור העניין בתוך הפרוסה ומקד את המיקוד על פני השטח. כבה את האורות וסגור את דלת ארון ההקלטה, כדי להפחית את רמות תאורת הרקע.
חבילות תוכנה מסחריות או פתוחות רבות זמינות להקלטה וניתוח של תמונות. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בתוכנת inspector של Lavis Biotech לצורך רכישת תמונות. כדי להתחיל בצילום, בחרו במצב מצלמת CCD לגילוי. הגדירו את אורך הגל הרלוונטי לאינדיקטור שלכם.
עבור fira 2:00 AM Ester, הגדרנו את העירור ל-820 nanometers בתוכנת ה-trim scope. בחרו במצב סריקה 64 B. בחרו את גודל שדה הראייה והרזולוציה לפיקסל האופטימליים עבור אזור העניין שלכם.
בחר קצב פריימים וסיבוב פיקסלים (pixel spinning) מתאימים במידה והם נדרשים לדגימת התמונה שלך. פתח את תריס הלייזר כדי להיות מוכן לדימוי רציף. השתמש במצב דימוי רציף.
כווננו את ההגבר ועוצמת הלייזר והתמקדו ברשת הנוירונלית שברצונכם לדגום. הפסיקו את הסריקה. בחרו את הגדרות ה-time-lapse עבור קצב הפריימים ומשך הרצף.
לאחר בדימות בשיטת time-lapse, צרו Z stack של תמונות המקיף 20 microns מעל ו-20 microns מתחת, במרווחים של micron אחד. Z stack זה משמש לזיהוי תאים במהלך הניתוח. ייצאו את הקבצים שהוקלטו כסטה של תמונות TIFF.
לסיכום, הדגמנו את השימוש באינדיקטורים לסידן למדידת פעילות רשתית ספונטנית וסנכרונית בקליפה המוחית המתפתחת. פרטים נוספים על המתודולוגיה והריאגנטים ניתן למצוא בגיליונות הנתונים המלווים סרטון זה, כדי לאפשר לכם להקים את הטכניקה במעבדה שלכם.
סקירה כללית
מחקר זה מדגים שיטה למדידת פעילות רשתית בחתכי מוח קורטיקליים בשלבי התפתחות באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים הרגישים לסידן. הפרוטוקול מאפשר תצפית על פעילות סנכרונית ספונטנית ברשתות נוירונליות באמצעות טכניקות דימוג מתקדמות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות דימות
רקע
- מדדי פלואורסצנציה רגישים לסידן משמשים למדידת פעילות עצבית.
- פעילות סנכרונית ספונטנית היא סימן היכר של רשתות עצביות בשלבי התפתחות.
- ניתן לצבוע סוגים שונים של תאים, כולל נוירונים ואסטרוציטים, לצורך דימוי.
- דימוי רב-פוטוני בשיטת Time-lapse מאפשר תצפית ברזולוציה גבוהה של פעילות הרשת.
מטרת המחקר
- להדגים את השימוש בדימות סידן לבדיקת פעילות תפקודית ברקמת קורטקס של עכבר בשלבי התפתחות.
- להמחיש שיטות למדידת תבניות של פעילות ספונטנית ופעילות מושרית.
- לספק פרוטוקול להכנה ולדימות של פרוסות מוח.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת פרוסות מוח מקליפת המוח של עכבר בשלבי התפתחות.
- טעינת תאים במחווני סידן (calcium-dependent indicators).
- דימוי רב-פוטוני בשיטת Time-lapse להקלטת פעילות רשתית.
- ניתוח שינויים בפלואורסצנציה להערכת פעילות תאית.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של פעילות מסונכרנת ברשתות נוירונליות.
- הדגמה של יעילותם של צבעים רגישים לסידן בלכידת שינויים דינמיים בפלואורסצנציה.
- זיהוי דפוסי פעילות ספונטנית ברשתות קורטיקליות בשלבי התפתחות.
- השגת רזולוציה מרחבית גבוהה באמצעות טכניקות דימות מתקדמות.
מסקנות
- השימוש בדימוי סידן מספק תובנות בעלות ערך לגבי הפעילות התפקודית של רשתות נוירונליות בשלבי התפתחות.
- ניתן להתאים שיטה זו לתרביות נוירונליות שונות ולשלבי התפתחות שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקות אלו כדי לחקור לעומק את הדינמיקה של רשתות נוירונליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי סידן תפקודי מאפשר מיפוי ברזולוציה גבוהה של פעילות סנכרונית ספונטנית ברשתות קליפה (cortical networks) בשלבי התפתחותן, תהליך מרכזי בהתפתחות העצבית המוקדמת. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) על ידי קישור הדינמיקה של הרשת למנגנוני היווצרות מעגלים הרלוונטיים למודלים של הפרעות נוירופסיכיאטריות. הטכניקה מספקת ביטחון חזוי במודלים פרה-קליניים על ידי לכידה של מדדים תפקודיים המתואמים עם הבשלה סינפטית ופלסטיות.
יישומים אסטרטגיים במו and פיתוח (R&D) של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת זרימת סידן ברמת הרשת כמדד לעירור עצבי וקישוריות סינפטית.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות דפוסי פעילות מסונכרנים המשקפים הבשלה של מעגלים תפקודיים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי תרכובים המודולים סנכרון של רשתות במערכות קורטיקליות מתפתחות הרלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עם סימון ספציפי לסוגי תאים (נוירונים ואסטרוציטים) עבור סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- פלט כמותי: אספקת אותות delta F/F עם רזולוציה מרחבית גבוהה ודגימה זמנית, המאפשרים זיהוי של שינויים בפעילות על פני רשתות רב-תאיות.
- יכולת הרחבה של הסריקה: מקלה על הערכה אמינה של תרכובות על ידי לכידה של תגובות ברמת הרשת כולה במקום מדידות של תא בודד, ובכך משפרת את הרלוונטיות הפיזיולוגית של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תפקוד לקוי מוקדם של רשתות קורטיקליות המעורב בהפרעות התפתחותיות-עצביות, ובכך תומך בהתאמה של סממנים ביולוגיים תרגומיים.
- המשכיות פרה-קלינית: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת מדד תפקודי של פעילות הרשת שניתן לעקוב אחריו לאורך שלבי ההתפתחות.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי מדידת השפעת תרכובות על סנכרון רשתי ספונטני, המהווה אינדיקטור מכניסטי לשלמות המעגלים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת נתונים על פעילות רשת תפקודית, המנחים החלטות לגבי מעורבות המטרה (target engagement) ואופטימיזציה של מולקולות מובילות (lead optimization) לפני תיקוף in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של יעדים נוירו-התפתחותיים על ידי מדידת שינויים בסנכרון הרשת כסמן ביולוגי תפקודי של היווצרות מעגלים.
- סריקה: מספק קריאות של זרימת סידן הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה ברזולוציה תאית, מה שמאפשר השוואה של השפעות תרופתיות בין אוכלוסיות נוירונליות וגליאליות.
- אנליטיקה: מייצר מדידות כמותיות של delta F/F המאפשרות לצוויות להשוות בין תנאים ולהעריך מודולציה של דינמיקת הרשת המושרית על ידי תרכובות.
- מחקר תרגומי: מתחבר לרצף הפרה-קליני על ידי מידול דפוסי פעילות הידועים כווסתים של סינפטוגנזה ופלסטיות, תהליכים המופרעים במצבים נוירופסיכיאטריים.
- שימוש חוזר ארגוני: מקים פלטפורמת דימות לשימוש חוזר למחקר אורכי של התפתחות הרשת תחת הפרעות גנטיות ופארמקולוגיות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף יעדים על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות תצפית ישירה על פעילות ברמת הרשת.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה וחזרתיות באמצעות פרוטוקולים מוגדרים להכנת פרוסות, טעינת צבע ודימוי.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של יעדים, בהתבסס על פנוטיפים תפקודיים של הרשת ולא רק על קישור מולקולרי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי זיהוי תרכובות המשחזרות או מווסתות סנכרון רשתי פתולוגי במודלים קורטיקליים בשלבי פיתוח.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במדעי המוח, מיקרוסקופיה רב-פוטונית וטיפול בחסמי דימוי סידן.
- תלוי בגישה ללייזרים מסוג טיטניום-ספיר, מערכות רב-פוטוניות ובקרת סביבה לשמירה על חיוניות הפרוסות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי הנוירוביולוגיה והדימוי להכנת פרוסות וניתוח נתונים עקביים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הטכניקה לשלבי התפתחות שונים או למודלים של מחלות.
- מוגבל על ידי פוטו-בליצ'ינג (הלבנה פוטוכימית) ורעילות הצבע במהלך דימוי ממושך, מה שמחייב אופטימיזציה של עוצמת העירור ותנאי האינקובציה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:03
Title
3:00
Step 1 Making horizontal hippocampal/cortical slices from young mouse brain
5:57
Step 2 Preparation of the staining chamber
8:48
Step 3 Staining of slices
10:21
Step 4 Non-neuronal dyes and older tissue
12:02
Step 5 Attaching slice to recording chamber
13:36
Step 6 Imaging
15:58
Conclusion
