ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו
13 במאי 2012
שיטה זו מאפשרת ניטור של תאים בזמן אמת מדידות כמותיות של פרמטרים שונים הגירה סלולריים כגון מהירות, תזוזה, ומהירות. שלא כמו שיטות מסורתיות, גישה זו בזמן אמת אינה מבוססת על מדידות כמותיות נקודות קצה הגירה, אלא היא מאפשרת ניטור חישוב פרמטרים שונים ברציפות.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למדוד באופן כמותי את נדירת התאים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית time lapse וידאו. דבר זה מושג תחילה על ידי ציפוי של פלטת תרבית בעלת שישה בארות בקולגן, ולאחר מכן זריעה דלילה של התאים הרלוונטיים על הפלטה המצופה. כשלב שני, נוצר פצע בפלטה באמצעות קצה של פפטה, כדי להבטיח שטח מספיק לנדירה.
בשלב הבא, המיקרוסקופ מוגדר ותמונות נלכדות במרווחי זמן קבועים תוך שימוש במערכת לבקרת טמפרטורה, כדי לאפשר ניטור רציף של תאים נודדים בזמן אמת. לבסוף, נעשה שימוש בפרוטוקול מעקב אחר חלקיקים (particle tracking) כדי להעריך הבדלים במהירות הממוצעת ובהעתקה הכוללת של תאי הבקרה ותאי הניסוי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת נדידה בתא חסימה (avoidant chamber migration assay), הוא שאינה מתבססת על מדידות כמותיות של נדידה בנקודת הסיום.
במקום זאת, היא מאפשרת ניטור וחישוב של פרמטרים שונים באופן רציף. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, כגון כיצד גנים או תרופות מסוימים משפיעים על נדידת תאי גידול? יומיים לפני הפרוצדורה, הוסיפו 1.5 milliliters של קולגן המדולל ב-opti media לכל באר של פלטת תרבית בעלת שש בארות, ולאחר מכן דגרו את הפלטה למשך הלילה בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius יום אחד לפני הפרוצדורה.
שעייקו מחדש את התאים הרלוונטיים בשני מיליליטר של DMEM בתוספת FBS לכל באר, והעבירו את התאים לכל באר בלוחית המצופה ב-collagen ENC, תוך דגירה של התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C. ביום הפרוצדורה, השתמשו בקצה פפיתה כדי ליצור פצע בתאים שהודגרו במהלך הלילה, ושטפו כל באר עם PBS כדי להסיר שאריות שנוצרו כתוצאה מהפצע.
הוסיפו DMEM בתוספת FBS לבארים שנשטפו, ולאחר מכן בדקו תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שנוצר חלל פצע נקי. לאחר הפעלת מצלמת המיקרוסקופ ומערכת הדמיות התאים החיים, מקמו את הפלטה על משטח המיקרוסקופ. כסו את הפלטה בעזרת תא הבקרה הסביבתי החדש לתאי חיים, והגדירו את התרמוסטט ל-37 °C ואת הפחמן הדו-חמצני ל-5%. כעת פתחו את תוכנת ה-slide book בשורת התפריטים.
בחרו בבקרת פוקוס על ידי לחיצה על כפתור ה-F בתוך המעגל. בתיבת העדשה, השתמשו בחלון התפריט הנפתח כדי להגדיר את העדשה. בתיבת סט המסננים, בחרו בהגדרות המכוונות את נתיב האור אל רכיב ה-I. בחרו במסנן המתאים לתאורת שדה בהיר (Bright Field Illumination), ולאחר מכן לחצו על open Bright.
יש לפתוח את תריס השדה המואר (bright field). כעת בחרו במסנן השדה המואר על הצריח והביטו בדגימה דרך העין כדי למצוא את השדות המתאימים ולהביא את הדגימה למיקוד. לאחר מכן, הסיטו את צריח המסננים כדי לשנות את נתיב האור אל המצלמה. לצורך לכידת תמונה בתוכנת ה-slide book, לחצו על בקרת המיקוד (focus control), בחרו ב-XY כדי לבחור מיקומים שונים דרך העין, ולאחר מכן לחצו על set point כדי לנעול כל מיקום.
לצורך לכידת תמונות, כוונו ידנית את המיקוד של תמונת המצלמה הנצפית על המסך, ולאחר מכן השתמשו בכלים בחלון בקרת המיקוד כדי להתאים את מיקום ה-Z של הבמה. לקבלת התוצאות המיטביות, מומלץ למקד בליטות תאיות שטוחות הסמוכות למגע עם הפלטה כדי לסייע במיקוד. השתמשו בסרגל הגרירה כדי להתאים את זמני החשיפה לטווח המתאים למיקוד.
אם נבחרו מספר מיקומי XY, יש לכוון את המיקוד עבור כל מיקום בנפרד באמצעות בחירה בבקרת המיקוד (focus control). לאחר מכן, יש לבחור ב-xy, ולאחר מכן ב-visit point. ב-slide book, יש לבחור את גרפיקת המצלמה משורת התפריטים, לבחור את סוג הלכידה (capture type), ולאחר מכן ב-time lapse כדי לקבוע את משך הזמן של הניסוי.
בתפריט הנפתח, הקלידו את ההשהיה הרצויה בין תחילתו של נקודת זמן אחת לתחילתה של הבאה. בשדות הרווח, השדה השלישי יחושב באופן אוטומטי מהערכים שהוזנו ידנית. תחת לכידת XY מרובה (multiple XY capture), בחרו ברשימה רב-נקודתית (multi-point list) עבור ניסויים הכוללים יותר ממיקום XY אחד.
לבסוף, תנו שם לקובץ כדי לשמור אותו, עברו לבקרת הלכידה (capture control) ובחרו ב-"advanced" ולאחר מכן ב-"spool". לאחר מכן, בצעו לכידה לזיכרון ושמירה לקובץ ה-spool לאחר כל נקודת זמן. התחילו בלחיצה על image.
בסרגל התפריטים של ספר השקופיות (slide book), בחרו "import" מהתפריט הנפתח, ולאחר מכן לחצו על "slide book spool". בחרו את קבצי ספר השקופיות הרצויים שהופקו מניסוי ההגירה עבור השדות ונקודות הזמן השונות. פתחו את הקובץ הראשון, לאחר מכן בחרו "mask" בסרגל התפריטים ובחרו "particle tracking protocol" מהתפריט הנפתח.
תחת תפריט מעקב החלקיקים (particle tracking), בחרו בפרוטוקול מעקב חלקיקים ידני. יופיע חלון עם נקודות זמן התחלה וסיום. כדי לנתח נדידה אקראית, בחרו במסכה (mask), ולאחר מכן בפרוטוקול מעקב חלקיקים. שוב, כדי לקבוע את הקואורדינטות למרכז האובייקט, בחרו במרכז השטח (center of area).
לאחר מכן לחצו על track and continue. כעת בחרו את הסטטיסטיקות הרצויות עבור כל נתיב, כגון displacement ו-average speed. כפי שמוצג כאן, לחצו על calculate כדי לצפות בסטטיסטיקות.
בתיבה זו מוצגת דוגמה לניתוח נדידה אקראית כפי שנמדדה במונחים של מהירות. בגרף ה-Whiskers בניסוי זה, נצפתה עלייה במהירות הממוצעת בתאי M-D-A-M-B 2 31 עם השתקה של גן מדכא גידולים. בהשוואה לתאי M-D-A-M-B 2 31 של הביקורת כאן, הנדידה האקראית של התאים מהאיור הראשון נותחה במונחים של העתקת תאים.
שוב, בקבוצה עם השתקה כוללת של הגן מדכא הגידול נצפתה תזוזה מוגברת של תאים בהשוואה לבקרת M-D-A-M-B 2 31. תאים בסרטון מיקרוסקופיית וידאו מסוג time lapse זה, תאי בקרת MDA MB 2 31, הושקעו על קולגן למשך לילה. התמונות צולמו לאחר מכן במרווחי זמן של שעה אחת, למשך 18 שעות בסך הכל, במהלך נדידה אקראית.
שימו לב כיצד התאים מתרחקים ממיקומם המקורי עם הזמן. בסרטון זה, נדגמה ונולחחה נדירתן של תאי M-D-A-M-B 2 31 לאחר זריעה למשך לילה על קולגן. שימו לב כי תאי הבדיקה הם בעלי יכולת נדידה גבוהה יותר בהשוואה לתאי הביקורת בסרטון הקודם.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון פלישת תאים (cell invasion) ו-dynas כדי להשיב על שאלות נוספות, למשל, מהם תפקידי התאים בגרורות סרטניות לאחר התפתחותן? טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור נדידת תאים באמצעות שורות תאים סרטניות מבודדות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
שיטה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת של נדידת תאים, ומספקת מדידות כמותיות של פרמטרים כגון מהירות, התקדמות (displacement) ווקטור מהירות (velocity). בניגוד לשיטות מסורתיות, גישה זו עוקבת באופן רציף אחר פרמטרים אלו במקום להסתמך על מדידות של נקודת סיום.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה
- נדידת תאים
רקע
- נדידת תאים היא תהליך קריטי בהקשרים ביולוגיים שונים.
- שיטות מסורתיות מודדות לעיתים קרובות נדידה בנקודת סיום בודדת.
- ניטור בזמן אמת יכול לספק תובנות מפורטות יותר לגבי דינמיקת נדידה.
- מיקרוסקופיית Time-lapse בווידאו היא כלי רב עוצמה לתצפית על התנהגות תאים חיים.
מטרת המחקר
- למדידה כמותית של נדידת תאים בזמן אמת.
- להשוואת פרמטרי נדידה בין תאי ניסוי לתאי ביקורת.
- לשיפור טכניקות קיימות למדידת נדידה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ציפוי של פלטת תרבית בעלת שישה בארות בקולגן.
- זריעה דלילה של תאים על הפלטה המצופה.
- יצירת פצע בפלטה כדי להקל על נדידה.
- שימוש במיקרוסקופיית time lapse בווידאו כדי ללכוד תמונות במרווחי זמן קבועים.
תוצאים עיקריים
- ניטור בזמן אמת אפשר הערכה רציפה של נדידת התאים.
- נמדדו הבדלים במהירות הממוצעת ובמעתק הכולל.
- הטכניקה סיפקה נתונים מפורטים יותר בהשוואה למדידות בנקודת סיום.
- תאי ניסוי ותאי ביקורת הפגינו דפוסי נדידה מובחנים.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את ההבנה של דינמיקת נדידת תאים.
- ניתוח בזמן אמת עשוי להוביל לתובנות טובות יותר במחקר בביולוגיה של התא.
- הגישה עשויה להיות ישימה לסוגים שונים של מחקרי נדידת תאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי בזמן אמת של נדידת תאים מאפשר לצוותי מו"פ בביו-פארמה להפחית סיכונים באימות מטרות על ידי אספקת נתונים רציפים ועשירים בפרמטרים על ניידות תאית. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הבחנה בין השפעות מכניסטיות של הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות על דינמיקת הנדידה. השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של השיטה מקלות על סנכרון רב-תחומי בין צוותי ביולוגיית הגילוי לצוותים הפרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות האופן שבו גנים או תרופות ספציפיים משנים את פרמטרי נדידת תאי גידול.
- ערך תפעולי: מספק ניטור רציף של מהירות ממוצעת והעתקה, ובכך מפחית את ההסתמכות על בדיקות נקודת-סוף הממסכות התנהגויות דינמיות.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו באמצעות זיהוי תרכובות או מטרות המשנות באופן משמעותי את ניידות התאים במערכות רלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של נדידה ברזולוציה של זמן, המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות ולאישור פגיעות (hit confirmation) בסינונים פנוטיפיים.
- ערך תפעולי: מאפשר מדידה הדירה של קינטיקת נדידה בתנאים מרובים באמצעות מעקב אוטומטי אחר חלקיקים ובקרות סביבתיות.
- סקלאביליות: תואם לפורמטים של לוחיות עם מספר בארות ולדימות בשיטת time-lapse, מה שמאפשר הערכה מקבילה של אוכלוסיות ניסוי וביקורת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תצפיות נדידה בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על תנאים רלוונטיים פיזיולוגית באמצעות בקרת טמפרטורה ו-CO2.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר האם שינויי נדידה שנצפו נובעים משינויים במנגנוני התנועתיות לעומת גורמים מתבלבלים של שרידות או פרולפרציה.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר קבלת החלטות go/no-go מבוססות נתונים על סמך פרמטרי נדידה חסונים סטטיסטית, ולא על סמך תוצאות נקודת-סוף בינאריות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולות המובילות (lead optimization), ומספקת קריאות כמותיות של נדירה המנחות את התהליך מהזיהוי הראשוני למולקולה מובילה (hit-to-lead progression).
- ביולוגיה של תגליות (Discovery Biology): תומך בבדיקת השערות על ידי מתן אפשרות להשוואה בזמן אמת של דינמיקת נדידה בין תאי פרא (wild-type) לתאים עם שינויים (perturbed cells).
- סריקה (Screening): מספק פלטיים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, כגון מהירות ממוצעת והעתקה כוללת, לצורך סריקת ספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: יוצר התפלגויות סטטיסטיות של פרמטרי נדידה המאפשרות השוואה קפדנית של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי (Translational Research): מקשר בין פנוטיפים של נדידה in vitro לבין פוטנציאל מטאסטטי באמצעות מעקב רציף אחר דפוסי פיזור תאיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר להערכת נדידה במגוון מודלים של תאי סרטן ותאי מערכת החיסון.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות בפירוש מנגנון הנדידה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות יצירת פצעים סטנדרטית, בקרה סביבתית ופרוטוקולים של מעקב אוטומטי.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של תרכובות שאינן גורמות לנדידה, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על פורטפוליו: מקל על תעדוף מותאם סיכונים של מועמדים מובילים (leads) בהתבסס על פרופילים כמותיים של דיכוי או הגברה של נדידה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדימות תאים חיים ובתוכנות למעקב אחר חלקיקים לצורך הפקת פרמטרים מדויקת.
- תלוי במערכות מיקרוסקופיה הפוכה עם תאי בקרה סביבתיים לוויסות טמפרטורה ו-CO2.
- מחייב סטנדרטיזציה של יצירת הפצע ושל צפיפות זריעת התאים כדי להבטיח השוואתיות בין ניסויים.
- התאמה למערכות תלת-ממדיות או למערכות מיקרופלואידיקה עשויה לדרוש שינויים בגישת יצירת הפצע ובדימות.
- מוגבל לתאים נצמדים המסוגלים לנדוד על משטחים מצופים בתנאים המכילים סרום.
