אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות
9 במרץ 2012
יש לנו אופטימיזציה טכניקה מיקרואנקפסולציה כפלטפורמה 3D יעיל להפצת והבחנה בתאי גזע עובריים כדי האנדודרם ואת דופאמין (DA) נוירונים. הוא גם מספק הזדמנות בידוד החיסונית של תאים המארח במהלך ההשתלה. פלטפורמה זו ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים.
פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לכדיסקפולציה של תאי גזע עובריים אנושיים פלוריפוטנטיים והגדרתם לנוירונים דופמינרגיים במערכת תלת-ממדית. ראשית, יש לטפל במושבות במעכב ROCK (או RI) ולפרק אותן לתאים בודדים בעזרת סודיום אלגינאט, ולאחר מכן להעבירם דרך מכשיר האנקפסולציה. יש להמשיך בטיפול ב-RI למשך שלושה ימים, להעביר את התאים המוקפסלים למצע PA six ולהבדילם למשך 28 ימים.
בסופו של דבר, ניתוחי ביטוי גנים וחלבונים מראים יעילות גבוהה יותר ביצירת נוירונים דופמינרגיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקול בידוד דו-ממדי (2D) קיים הוא הניסיון להנחיל ולהבדיל תאים אלו בסביבה תלת-ממדית (3D), וסביבה תלת-ממדית זו מאפשרת להנחיל את התאים בצפיפות גבוהה. בנוסף, היא מאפשרת אינטראקציה טובה יותר בין התאים לצורך הבידול.
ושלישית, הדבר יעניק לכם יעילות גבוהה יותר של דיפרנציאציה בהמשך התהליך. כמו כן, אם אוכל להוסיף, ניתן להתאים את הטכניקה הספציפית הזו גם לסוגים אחרים של תאים שניתן להגדיל בסביבה תלת-ממדית. כעת, זכרו גם שבעצם, לדוגמה, הטכניקה הספציפית הזו עברה אופטימיזציה על בסיס שימוש במעכב ROCK מסוים המונע אפופטוזה של התאים וכן מונע את ניתוק התאים ממעdishי התרבית.
בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקלו בקושי בתחילה, שכן טכניקה זו אינה מבוצעת בדרך כלל בתרביות רקמה. טכניקת הכליאה הבאה עברה אופטימיזציה בהתבסס על מחקרי הסיכום של Dr.Dean ו-Dr.Chad בנוגע ליישום של alginate מסוג R inhibitor, ריכוז alginate והגדרות מכשיר הכליאה. ג'יימי וקים, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלנו, ידגימו כעת פרוטוקול זה.
הוסיפו 25 milliliters של תמיסת ג'לטין סטרילית בריכוז 0.1% ל-275 milligrams של נתרק אלגינאט מpurified בתוך מבחנה סטרילית בנפח 50 milliliter; ערבבו באמצעות vortex כדי להמיס חלקית את אבקת האלגינאט. לאחר מכן, הניחו את המבחנה על מערבל אורביטלי (orbital mixer) במהירות של 10 times G למשך לילה. לבסוף, הוסיפו נתרק כלוריד סטרילי בריכוז 9% לתמיסת האלגינאט.
ערבבו במיקסר (Vortex) למשך 30 שניות ולאחר מכן סובבו בצנטריפוגה ב-95 ×g למשך חמש דקות. שמרו את תמיסת האלגינאט בטמפרטורה של 4 °C. ראשית, בסביבה חשוכה, הכשילו את תאי הגזע העובריים של בני אדם באמצעות מצע גידול המועשר ב-10 µM של מעכב ROCK.
דגרו למשך שעתיים ב-37 °C. כעת שטפו את התאים פעמיים עם DPBS כדי לשחרר אותם אנזימטית. הוסיפו accutane ודגרו למשך 10 דקות.
בטמפרטורה של 37 °C, קצרו בעדינות את התאים באמצעות גורר תאים (cell scraper) והעבירו אותם לשפרוֹר של 15 ml. נטרלו את ה-Accutane באמצעות נפח שווה של מצע SL. לאחר מכן, העבירו את התאים המנוטרלים דרך מסנן של 40 micron לשפרוֹר צנטריפוגה נקי של 50 ml.
כעת השתמשו במערך ספירה של תאי דם (hemo cytometer) כדי לספור את התאים. השקיעו את התאים על ידי צנטריפוגה ורוקנו בזהירות את הנוזל העליון (supinate). לאחר מכן, שטפו את התאים פעם אחת עם תמיסה שחוממה מראש.
0.9% sodium chloride. סוביב את המשקע בצנטריפוגה והסר את הנוזל העליון. כדי לאכסן את תאי הגזע העובריים האנושיים, התחל על ידי השהיית התאים בתמיסת אלגינט שחוממה מראש.
כדי לבצע זאת, חברו מזרק של 20 milliliters לצינור פלסטיק רך ושאבו אלגינט לתוך המזרק. לאחר מכן, ערבבו בעדינות את תגלה התאים באמצעות המזרק מבלי ליצור בועות. כעת, שאבו את התאים לתוך המזרק.
השליכו את צינור הפלסטיק ואז חברו את המזרק למכשיר הכמיסה. המשיכו להגדרת המכשירים של מחולל החרוזיים, משאבת המזרקים, מד זרימת האוויר ואמבט השקיעה של calcium chloride. ודאו שקיים רווח של 10 centimeter בין קצה מכשיר הכמיסה לנקודת האיסוף בצלחת הפטרי.
בשלב הבא, כוון את משאבת המזרקים ל-10 milliliters לשעה. קצב זרימת האוויר ל-eight liters לדקה ולחץ של 100 kilo pascals. אסוף את התאים המעטפים לתוך אמבט שיקוע שחומם מראש למשך שבע דקות.
לאחר מכן, העבירו אותם באמצעות שאיבה עדינה לפרועת צנטריפוגה של 50 milliliters המכילה 20 milliliters של 0.9% Sodium chloride. המתינו עד שהקפסולות ישקעו לתחתית הפרועת, השליכו בעדינות את הנוזל העליון, ולאחר מכן שטפו פעם אחת עם 0.9% Sodium chloride. המשיכו להשעות את התאים העטופים במצע גידול שחומם מראש, בתוספת מעכב רוק (rock inhibitor). העבירו לבקבוק תרבית והדגירו למשך שלושה ימים.
זריעה של תאי קו הסטרומה של עכבר PA six בבקבוק T 75 מצופה בג'לטין בריכוז 0.1%, וה conditioning של מצע דיפרנציאציה עצבית דופמינרגית למשך 24 שעות. העבירו את הקפסולות לפראנל צנטריפוגה בנפח 50 milliliter והמתינו עד ששקעו לתחתית הפראנל. השליכו את הנוזל העליון והשביו את הקפסולות במצע דיפרנציאציה עצבית דופמינרגית המותנה בתאי PA six.
תרבית מצע. תאי הגזע העובריים האנושיים העטופים עם שכבת תאים אחת של PA six למשך 21 ימים. בעת חידוש המצע, יש להחליף את המדיה.
בכל פעם השתמשו רק בחצי מהמצע כדי להמשיך את תרבית תאי ה-PA six בדיפרנציאציה עצבית דופמינרגית. מצע זה מועשר בגורמי השראה למשך שבוע אחד. ראשית, שאבו את הקפסולות והעבירו אותן למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר.
כאשר הקפסולות שוקעות לתחתית, השליכו את הנוזל העליון. שטפו פעמיים עם DPBS, והשליכו את הנוזל העליון. לאחר מכן, הוסיפו חמישה milliliters של תמיסת decap ululating וערבבו את התרחף היטב.
דגרו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סבב צנטריפוגה של המשקע, ניתן להשתמש בתאי ה-decap, לאחר שטיפה כפולה עם DPBS, כתרבית בשכבה אחת (monolayer) או לניתוחים המשכיים מיידיים. בהכנה טיפוסית, קוטר המיקרו-קפסולות של האלגינאט הוא בין 400 ל-500 מיקרון.
כאן מוצג בדיקת C-F-D-A-P-I. התוצאות קובעות את התאים העטופים החיוניים המסומנים בירוק ב-80%ניתוחים של חיוניות, פרוליפראציה ואפופטוזה של תאי גזע עובריים אנושיים עטופים בנקודות זמן שונות משמשים לאופטימיזציה של תנאי התרבית. באופן מעניין, השפעות של מעכב rock מונעות אפופטוזה המושרית על ידי הדיסוציאציה ושומרות על חיוניות התאים, עם אינדיקציה לצמיחה עדיפה של תאי גזע עובריים אנושיים עטופים שגודלו ב-H-F-F-C-M בתוספת ri.
דוגמה זו מיישמת כליאה של תאים כפלטפורמה תלת-ממדית להגhautה של תאי גזע עובריים אנושיים כלואים לנוירונים דופמינרגיים. כצפוי, גודל גופי העוברית גדל עם הזמן; עם הסרת הכליאה, התאים מראים מורפולוגיה נוירונלית פרוגרסיבית לאחר יומיים עד שלושה ימי תרבית, עם חיוניות של למעלה מ-90%. ניתוח ביטוי גנים מעיד על דה-רגולציה (downregulation) של הסמן הפלוריפוטנטי OCT four.
חשוב לציין כי הסמן לתאי מוצא עצביים PAC six והסמן לנוירונים דופמינרגיים th נותרים מועלים לאחר שבעה ימי דיפרנציאציה. תאי גזע עובריים אנושיים שעברו דיפרנציאציה נוספת מראים למעלה מ-90% נוירונים חיוביים ל-TH לאחר 21 ימים. ניתוח Western blot מאשר את דפוסי הביטוי המועדפים של TH ו-PAC six במערכות תרבית תאים בתלת-ממד (3D) לעומת דו-ממד (2D).
לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ביעילות תוך שעתיים. זכרו לטפל בתאים עם מעכב Roc לפני ואחרי הכמוסה (encapsulation). ניתן להתאים את פרוטוקול ההבדלה התלת-ממדית לניסויים עתידיים באמצעות שימוש במעבדים או במעכבים של וריאנטים.
טכניקה ספציפית זו של הכמיש של ESL אנושיים והגאלתם תחת סביבה תלת-ממדית, או לצורך פוטנציאל לטיפול תאי במספר מחלות, ובמיוחד במחלת הפרקינסון.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכניקה אופטימלית של מיקרו-כמיסה (microencapsulation) להנחלה ודיפרנציאציה של תאי גזע עובריים לנוירונים דופמינרגיים בתוך סביבה תלת-ממדית. שיטה זו מחזקת אינטראקציות בין תאים ומאפשרת בידוד חיסוני במהלך השתלה.
מרכיבי המחקר המרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאי גזע
- דיפרנציאציה של תאים
רקע
- תאי גזע עובריים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים.
- נוירונים דופמינרגיים הם קריטיים לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות.
- מערכות תרבית בתלת-ממד משפרות את צמיחת התאים ואת התמיינותם.
- טכניקות של מיקרו-נקפסולציה יכולות לשפר את הישרדות התאים במהלך השתלה.
מטרת המחקר
- לאופטימיזציה של טכניקת מיקרו-אנקפסולציה עבור דיפרנציאציה של תאי גזע.
- לשיפור היעילות של יצירת נוירונים דופמינרגיים.
- לספק פלטפורמה לבידוד חיסוני של תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תאי גזע עובריים אנושיים פלוריפוטנטיים טופלו במעכב ROCK.
- התאים נכלאו (encapsulated) באמצעות סודיום אלגינאט ומכשיר לכליאה.
- תאים כלואים תורגלו לצורךהתמיינות לאורך 28 ימים.
- ניתוחי ביטוי גנים וחלבונים בוצעו כדי להעריך את יעילות ההתמיינות.
תוצאות עיקריות
- טכניקת המיקרו-אנקפסולציה התלת-ממדית שיפרה באופן משמעותי את ייצור הנוירונים הדופמינרגים.
- נצפו צפיפות תאים גבוהה יותר ואינטראקציות טובות יותר בין תאים.
- ניתוחים של ביטוי גנים וחלבונים אישרו יעילות דיפרנציאציה משופרת.
- שיטה זו מציעה יתרונות לעומת פרוטוקולי דיפרנציאציה דו-ממדיים מסורתיים.
מסקנות
- טכניקת המיקרו-אנקפסולציה האופטימלית יעילה עבור התמיינות תאי גזע.
- מערכות תרבית בתלת-ממד מספקות יתרונות משמעותיים להנחאת תאים.
- ניתן להתאים גישה זו לסוגי תאים אחרים ברפואה רגנרטיבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פלטפורמות של מיקרו-קפסולות אלגינט תלת-ממדיות מאפשרות הגברה ניתנת להרחבה ודיפרנציאציה מכוונת של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC), תוך שיפור החיוניות והספציפיות לשושלה התאית. מערכת זו נותנת מענה לאתגר של שחזור הנישה של תאי הגזע, ובכך תומכת בביטחון חזוי בקווי ייצור של טיפול בתאים ורפואה רגנרטיבית בשלבים מוקדמים. גישה זו מעלה את ערך הפורטפוליו על ידי מתן אפשרות לתרביות חסונות בצפיפות גבוהה ויצירה יעילה של סוגי תאים הרלוונטיים למחלה עבור מחקר תרגומי בהמשך התהליך.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- תומך בחקירת מסלולי התמיינות של תאי גזע במיקרו-סביבה תלת-ממדית מבוקרת.
- מאפשר תיקוף תפקודי של התמיינות ספציפית לשושלת תאים, כגון יצירה של נוירונים דופמינרגיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי בידוד השפעותיהם של רמזים מהסביבה המיקרובית על גורל התא.
- משפר את הביטחון החזיוי עבור היפותזות טיפוליות מבוססות תאים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מערכת תלת-ממדית הניתנת לשחזור להערכה כמותית של יעילות הדיפרנציאציה.
- מאפשר סטנדרטיזציה של מדידות חיוניות, פרוליפרציה ואפופטוזיס בין תנאים שונים.
- מכין אוכלוסיות תאים מאושרות עבור סריקת תרכובות במקביל או בדיקות פנוטיפיות.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור סוגי תאים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות על ידי מתן אפשרות ליצירה יעילה של נוירונים דופמינרגיים למחקר של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- שומר על רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי תמיכה בחיוניות גבוהה ובנאמנות לשושלת התאים.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מועמדים לטיפול תאי תוך התחשבון בסיכונים.
- מאפשר ביצוע מחקרי בידוד חיסוני הרלוונטיים למחקר השתלה.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
שיטת הכלילה התלת-ממדית (3D) משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ובכך היא תומכת הן בתיקוף המטרה והן ברציפות טרנסלציונלית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות לגבי מחויבות לשושלת תאים והשפעות של המיקרו-סביבה.
- סריקה: מספקת תרביות סטנדרטיות בצפיפות גבוהה לקבלת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- אנליטיקה: מספקת נתוני ביטוי של גנים וחלבונים לצורך ניתוח השוואתי של פרוטוקולי דיפרנציאציה.
- מחקר תרגומי: תומכת ביצירת סוגי תאים רלוונטיים למחלה עבור מידול פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמה ניתנת להתאמה עבור סוגי תאים ופרוטוקולי דיפרנציאציה מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בדיפרנציאציה של תאי גזע.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקילביליות של זרימות עבודה בתרביות תאים בתלת-ממד.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) ויעילות הון על ידי מתן נתונים חסונים בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון של תוכניות לטיפול תאי ורפואה רגנרטיבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים בתלת-ממד ובהפעלת התקן הכליאה.
- דורש גישה לתשתית אנליטית לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכליאה וההבחנה.
- ניתן להתאמה לסוגי תאים שונים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול להשגת תוצאות ספציפיות לשושלת התאים.
- עקומת למידה ראשונית עבור משתמשים חדשים שאינם מכירים טכניקות כליאה בתלת-ממד.
