מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

בנוהל זה, אנו מציגים גישה של מיקרוסקופיה תוך-חיה (intravital) כמותית להערכת הדינמיקה של מעבר טפילים דרך הטחול. במודל של מלריה במכרסמים, עכברים שנדבקו בטפילים טרנסגניים המבטאים GFP מוכנים למיקרוסקופיה תוך-חיה של הטחול; קניולציה של וריד הטחול תאפשר הזרקה של צבעים תוך-חיים. במהלך הניסוי, מצולמים תאים פלואורסצנטיים הנעים באזורים שונים של הטחול.

אנו מספקים את המתודולוגיה לתיאור ניידות טפילים במדור האיטי התלת-ממדי של המחית האדומה ומחשבים את זרימת הדם בכלי הדם. פרמטרים אלה שימשו להשוואת הדינמיקה של הטחול בשני זני PULE. שלום לכולם.

שמי הוא Nando El Portillo ואחת משאלות המחקר המרכזיות במעבדה שלי היא הניסיון להבין את תפקידו של הטחול במלריה. Splenomegaly היא אחד מסימני ההיכר של מחלה זו, אך בשל בעיות טכניות ואתיות, ניסיון לבצע מחקרים על איבר זה הוא קשה מאוד. כדי לעשות זאת, הפעלנו טכנולוגיות המאפשרות לנו לראות את המעבר הדינמי של טפיל זה ולכמת תופעה זו.

זהו הדבר שלורנה ו-MI יסבירו בפרוטוקולים אלו. מחקר זה נערך בחלקו בשיתוף פעולה עם הקבוצות של ד"ר Ler מאוניברסיטת המבורג בגרמניה וד"ר מריה Kbo כאן בבית החולים Clinic, וקיבל מימון כללי מהקרן fion Cellex ומשרד ה-CIA בספרד. הזיהום מתחיל עם תורם M שהודבק בטפילים GFP, קטלניים או לא קטלניים, בריכוז של 10% טפילים. כדי לבדוק את נוכחות הטפילים, קחו טיפה קטנה של דם מווריד הזנב של העכבר והפריסו אותה על גבי מיקרוסקופ.

בצעו צביעה כולומטרית עם תמיסת GIMs על שקופית. הפתרון יאפשר ויזואליזציה של תאי דם אדומים נגועים לאחר ייבוש; קבעו את מריחת הדם באמצעות Methanol למשך שתי דקות, מרחו את תמיסת ה-GIMs והדגירו למשך 20 דקות. שטפו את השקופית במי ברז זורמים ויבשו. ספרו את אחוז ה-pbcs מתוך סך כל ה-RBCs באמצעות מיקרוסקופ אור עם עדשה שמנית של 100x עם שמן.

הדביקו עכברים בטפילים קטלניים או לא קטלניים שהושגו מדם הזנב של עכברי תורם המדולל ב-PBS. התאימו את המינון להזרקת חצי מיליון טפילים לכל עכבר, כדי להגיע לעומס טפילים פריפריאלי של 1% ביום השלישי לאחר ההדבקה, והזריקו באופן תוך-peritoneal (Intraperitoneal). לחלופין, ניתן להשתמש ב-RBCs המסומנים ב-FITC כביקורת.

אספו מיליליטר אחד של דם עורקי מעכבר ושטפו את המשקע על ידי סבוב במרכז centrifuge ב-PBS המכיל EDTA, השבילו בפתרון FITC והדגירו למשך שעתיים בחושך תוך써 ערבול עדין. לאחר זמן זה, הסירו את העילוי על ידי סבוב במרכז centrifuge ושטפו באופן יסודי. הגזירה לעכבר בקרה כדי להגיע לממוצע של 1% בסירקולציה פריפריאלית והמשיכו לניסויים in vivo.

שלום, אני מיז'ה. כדי לדמות את הטחול in vivo, עלינו לבצע ניתוח קטן בבעל החיים כדי לחשוף את הטחול; כמובן שאת הטכניקה הזו למדתי מסטיפני GR במעבדה של ווקר הייסלר, שאתה אני מבקשת להודות לו, וכעת אראה לכם כיצד לפעול.

דימוי של מיאוזיס מזוהם בוצע ביום השלישי לאחר ההדבקה, כאשר הפרט הוא 1% בשני הזנים. יש להשאיר את העכבר תחת הרדמה ובטמפרטורה מזורגלת לאורך כל הפרוצדורה. יש להגן על העיניים מפני התייבשות ולוודא שהעכבר מורדם לחלוטין על ידי נקישה על כרית כף הרגל לפני ההמשך, כדי להקל על מתן חומרים בווריד.

במהלך הניסוי, בצעו קניולציה של וריד הזנב בעכבר להקמת הקניולה. הכניסו מחט קטנה לקצה אחד של צינור ואת המיישם שלו לקצה השני. מלאו את הקניולה בתמיסת סליין פיזיולוגית תוך הוצאת בועות, ובדקו שהתמיסה זורמת כראוי דרך הקניולה.

יש לבצע קנולציה נקייה של הווריד הצדי (lateral vein) בזנב. הגבירו את נראותו של הווריד על ידי ביצוע לחץ קל בבסיס הזנב. הכניסו את קצה הקנולה לתוך הווריד.

הופעת דם תעיד על כך שהמחט ממוקמת היטב. אם לא, חזור על פעולת הקניולציה במעלה הווריד, ולאחר מכן קבע את הקניולה לזנב באמצעות דבק וסרט הדבקה. חשוף את החלק התחתון של הטחול באמצעות חתך קטן בעור ובשרירים בצד הגבי השמאלי של בעל החיים.

הנח את הטחול במיקום שבו נצפתה תנועת נשימה מועטה, ומרח PBS על השטח החשוף כדי לשמור עליו נקי משערות העכבר ולהבטיח הידרציה. הנח כיסוי מגן על הטחול כדי לאפשר ויזואליזציה. שלום, שמי לורנה.

הפרוטוקול המוצג יאפשר לנו להדמיות את תנועת טפילי PULI דרך הטחול. הדבר התאפשר הודות לטפילים טרנסגניים המבטאים GFP. תרומה נדיבה מאת James Burnes מאוניברסיטת Drexel.

דימות של תנועת טפילים פלואורסצנטיים יאפשר לנו לדעת אם קיימים הבדלים בהתנהגות בין זנים קטלניים ללא-קטלניים. ניסויי המיקרוסקופיה הובילו לביצוע במיקרוסקופ מולטיפוטון של Leica, המצויד במערכת אינקובציה עם בקרת טמפרטורה ועדשה אובייקטיבית 63 x גליצרין. הניחו את בעל החיים על במה המיקרוסקופ עם כיסוי זכוכית כאשר הטחול פונה כלפי מטה אל העדשה.

הדמיה של הטחול בהגדלות נמוכות תספק מבט כללי על מבנה המיקרו-סירקולציה של האיבר. מחדים את המיקוד בטחול תוך שימוש באוטופלואורסצנציה של הרקמה, כאשר טפילים המסומנים ב-GFP נצפים בעודם עוברים באזורים השונים של הטחול. שלום, שמי מריה אלבו מהמרכזים המדעיים והטכנולוגיים של אוניברסיטת ברצלונה, ואנו נבצע הדמיה תוך-חיה (intravital imaging) של הטחול.

על מנת לחקור את זרימת הדם ואת הניידות של תאי דם אדומים נגועים, נשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בסריקה רזוננטית (resonant scan), המאפשרת הדמיה במהירות גבוהה המועילה מאוד למניעת השפעות תנועת האיבר. זהו מיקרוסקופ ספקטרלי המאפשר לבחור את טווח הראייה. כדי לבצע הדמיה מהירה מאוד, נבצע רכישה סימולטנית של שני סימוני הפלואורסצאין וההחזרה.

בחרו אזורים שונים להדמיה בעזרת RBC, השתקפות, ניגודיות וצבעי Vidal כדי להוכיח את המיקרו-וסקולטורה של הטחול. כעת נסביר כיצד למדוד את ניידות הטפיל בזרימת הדם בכלי הדם באמצעות מיקרוסקופיית Vidal ותוכנת Image J למעקב אחר תנועת הטפיל ברשת התלת-ממדית של המחית האדומה. רכשו תמונות בחמישה עומקי Z באמצעות מצב סריקה במהירות גבוהה.

המירה של ערימות תמונות לסרטוני צבע מקודדי Z כדי להקל על מעקב אחר תאים פלואורסצנטיים בודדים. מידע מפורט מסופק בטקסט למעקב אחר חלקיקים שונים לאורך זמן בעומק בכל סרטון באמצעות קואורדינטות X, Y, Z ו-T. ניתן לחשב פרמטרי ניידות, כגון כיווניות, מהירות ממוצעת וזמן שהייה, ולהציגם כמיפויי התפלגות כדי לאפשר ניתוח השוואתי בין אוכלוסיות של זנים. ניתן לצלם זרימה כלי דם בטחול על ידי הזרקה סיסטמית של מספר מולקולות פלואורסצנטיות המתוארות בטבלה התומכת, כגון דקסטרין.

ובאמצעות סריקה בניגוד השתקפות של תאי דם אדומים אנדוגניים, סרקו את זרימת הדם בקו המרכז על ידי הצבת כלי הדם באופן אופקי לכיוון סריקת הלייזר ושימוש בממוצע קו משופר (enhanced Line average). בתמונות אלו, הפסים הנובעים מתאים נעים ישמשו לחישוב זרימת הדם; צלמו כלי דם בעוביים שונים ובמהלך מחזור הלב השלם כדי לפצות על תנודות. הטחול נחשב מזה זמן רב כ"קופסה שחורה" במחקר המלריה, וכאן פיתחנו גישה של מיקרוסקופיה אינטרה-וייטלית כמותית כדי להשיג תובנה לגבי הדינמיקה של זיהום הפarasite וזרימת הדם באיבר זה, מה שמאפשר לנו להתייחס לשאלות ביולוגיות חשובות, כגון היצמדות in vivo של תאי דם אדומים נגועים לטחול.

תודה ו-.