הערכת הביטוי GFP ואת הכדאיות שימוש Cytometer תמונה מבוסס טלי
17 בנובמבר 2011
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מבחני כדאיות התא ביטוי הקרינה באמצעות Cytometer תמונה מבוסס טלי.
סרטון זה מדגים הליך לקביעת חיוניות תאים בתאים המבטאים GFP באמצעות הציטומטר מבוסס-תמונות tally. תאים שעברו טרנסדוקציה של GFP נצבעים באמצעות ערכת החיוניות tally viability kit dead cell red, הצובעת את כל התאים המתים באדום עם propidium iodide; התאים מועברים בפיפט לשקופית ניתוח תאי של tally ונטענים לתוך הציטומטר, אשר רוכש ומנתח תמונות בשדה בהיר (brightfield) ופלואורסצנציה באדום ובירוק. לאחר מכן נוצרים היסטוגרמות להצגת מספר התאים, גודל התאים, עוצמת הפלואורסצנציה של PI ועוצמת הפלואורסצנציה של GFP בהשוואה לציטומטריית זרימה מסורתית.
מערכת Tali יכולה לספק נתונים דומים בנוגע לחיוניות תאים וביטוי. עם זאת, ציטומטריה זו המבוססת על תמונות מספקת מידע ויזואלי נוסף על אוכלוסיית התאים הנבדקת. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ציטומטריה של זרימה או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הוא שהציטומטר של Tally המבוסס על תמונות מספק מידע כמותי וויזואלי בו-זמנית על דגימת התאים שלך.
בנוסף, מכשיר הספירה (tally instrument) קל יותר לשימוש, זול יותר ותופס שטח עבודה קטן יותר מאשר ציטומטר זרימה או מיקרוסקופ פלואורסצנציה. דבר זה מאפשר לחוקרים לבצע במהירות בדיקות כמותיות, כגון בדיקת חיוניות בתאים המבטאים GFP, ישירות על שולחן העבודה. בהליך זה, תאי U2 OS בריכוז של 1×10⁶ תאים למילליליטר הועברו טרנסדוקציה עם מבנה ויראלי של GFP המכוון לגרעין התא, כדי לסמן תאים מתים באמצעות propidium iodide; העברו 100 µL מתלי התאים למבחנה חדשה של מיקרו-צנטריפוגה.
שימו לב כי עבור הבדיקה מומלץ להשתמש בריכוז של 1x10⁵ עד 1x10⁷ תאים למילליליטר, אם כי הריכוז אינו חייב להיות מדויק. לאחר מכן, הוסיפו 1 µL של ריאגנט tally dead cell red. ערבבו קצרות באמצעות וורטקס, והדגירו את תערובת ריאגנט הצביעה והתאים בטמפרטורת החדר, בחושך, למשך דקה אחת עד חמש דקות.
לאחר הדגירה, עברו מיד לניתוח במכשיר ה-tally image-based cytometer. ה-tally משתמש בשקופיות ניתוח תאיות מפלסטיק חד-פעמי שתוכננו במיוחד עבור המכשיר. הקפידו תמיד להחזיק את השקופית בקצוות כדי להטעין אותה.
העבירו בבובט 25 µL של דגימה באיטיות לאחד מאזורי טעינת הדגימות בצורת חצי סהר. כאן, תאים שאינם צבועים ואינם טרנסדוקים המשמשים כביקורת נטענים בתא A, והתאים הצבועים המבטאים GFP נטענים בתא B. כדי לבצע בדיקת חיוניות בתאים המבטאים GFP, לחצו על G-F-P-R-F-P במסך הבית של הציטומטר. אפשרויות הבדיקה יופיעו אז מצד ימין; בחרו ב-GFP plus viability.
המכשיר ישאל לאחר מכן האם יש לתת שם לסדרת הדגימות כדי להגדיר את שם סדרת הדגימות. לחץ על "name now". לאחר מכן, הקלד באמצעות מסך המגע את שם סדרת הדגימות ולחץ על "save"; ה-tally cytometer יעבור באופן אוטומטי למסך המדידה.
בשלב הבא, כדי למדוד את הפלורסצנציית הרקע, לחץ על לשונית הרקע בחלק הימני התחתון של מסך המדידה כפי שניתן לראות כאן. הגדרת ברירת המחדל מציינת כי יצולמו תשעה שדות של תאים. כעת, כאשר דגימת הביקורת פונה הרחק מהמכשיר, הכנס את הפס לפתח הטעינה עד לעצירה.
אין להפעיל כוח בעת לחיצה על מסך הרקע לצורך הכנסת בקרת תאים חדשה ללא צביעה. הזריקה תימשך באופן אוטומטי לתוך המכשיר ותמונה חיה של התאים תוצג על המסך. בעזרת כפתור המיקוד, הגבילו את התאים למישור הראייה המתאים תוך כדי ביצוע המיקוד.
הזרימו את כפתור הזום האדום ל-4x או 16x. כדי לצפות טוב יותר באוכלוסיית התאים, התאים צריכים להיות כהים באופן אחיד עם הילה בהירה סביב כל תא. כפי שמוצג כאן, ייתכן שספירת התאים תהיה נמוכה מדי כאשר המעבר בין הרקע לקצוות התאים מטושטש, כך שגבולות התאים אינם מוגדרים היטב.
ייתכן שספירת התאים תהיה גבוהה מהממשי כאשר למרכז התא יש גוון בהיר ולהיקפו גוון כהה. לאחר שהתאים הובאו למיקוד, גע/י או לחץ/י להפעלת בקרת תאים לא צבועים. כדי למדוד את הפלואורסצנציה של הרקע, הציטומטר יצלם תמונות באופן אוטומטי ויציג תצלומיות של כל שדה ראייה.
סרגל ההתקדמות מספק עדכון שוטף של הניתוח. לאחר השלמת לכידת התמונה, הציטומטר פולט את הפלטה באופן אוטומטי ומספק את הנתונים מניתוח התמונות שנלכדו. נתונים שמורים מוצגים בתפריט הנפתח של לשונית הרקע.
לדגימת בקרת הרקע יוקצה אותו שם שניתן לניסוי. כדי להריץ את הדגימה של ה-GFP שעברה טרנסדוקציה ונצבעה ב-PI, הוצא את השקופית מהמכשיר, הפוך אותה והכנס אותה שוב כך שהדגימה שעברה טרנסדוקציה פונה הרחק מהמכשיר. לחץ על לשונית הדגימה ולאחר מכן לחץ על press כדי להכניס דגימה חדשה.
כאשר התמונה מופיעה על המסך, השתמש בגלגל המיקוד כדי להביא את התאים למיקוד. כפי שנעשה קודם לכן, לחץ על run sample להרצת הדגימה. לאחר השלמת לכידת התמונה, הנתונים מהניתוח יופיעו תחת הלשונית sample והציטומטר יפלוט את השקופית באופן אוטומטי.
השליכו את שקופית ניתוח התאים של ה-tally. כפסולת ביולוגית מסוכנת, לא ניתן להשתמש בשקופיות אלו שוב. לאחר הרצת הדגימה, ניתן להחיל ספי רגישות (thresholds) על הדגימה.
כדי לנתח אוכלוסיות תאים ספציפיות כאן, נתאים את הספים כדי לקבוע את אחוז התאים החיים והמתים. תחת לשונית הדגימה, עבור תאים המבטאים GFP, יופיעו מספר ואחוז התאים המבטאים GFP, תאים מתים המבטאים GFP והחיוניות הכוללת. מוצגים גם גודל תא ממוצע, מספר התאים שנספרו וריכוז התאים.
בנוסף, בתחתית המסך מוצגות תרשימי היסטוגרמה המציגים את גודל התאים, פלואורסצנציה ירוקה ופלואורסצנציה אדומה. כדי להגדיר את שער סינון גודל התאים, גע בתמונה הממוזערת של גודל התאים כדי לפתוח את ההיסטוגרמה של גודל התאים לצורך הסרת פסולת. הזז את פסי ההזזה הכחולים כדי להוציא מהניתוח אירועים גדולים וקטנים כאחד.
הקישו על apply כדי לכלול את התאים בתוך השערים. כדי להוסיף את פלואורסצנציית ה-GFP לניתוח, הקישו על התמונה הממוזערת של היסטוגרמת ה-GFP כדי לפתוח אותה.
הזיזו את סרגל ההגרה הכחול כדי לקבוע את סף החיתוך (threshold) מימין לשיא החלש ביותר. השתמשו בדגימת הביקורת כמדריך. פעולה זו מאפשרת לאנליזה לכלול את התאים החיוביים ל-GFP, אך להוציא תאים עם פלואורסצנציה עצמית (autofluorescent cells).
אוטופלורסצנציה נצפית לעיתים קרובות כאשר מולקולות ביולוגיות בתוך תאים עוברות עירור. הקשเพื่อ לאשר וחזור למסך הקודם. הנתונים המוצגים תחת לשונית הדגימה צריכים לשקף כעת את השערים (gates) ואת הסף שנקבעו עבור שני ערוצי הפלורסצנציה. לאחר מכן, כדי להפריד את התאים הצבועים ב-PI מהאוטופלורסצנציה או מכל רקע שנמצא בדגימה, לחץ שוב על התמונה הממוזערת של היסטוגרם ה-PI כדי לפתוח אותה.
פיסגת דגימת הביקורת תוצג כפיסגית אפורה בהיסטוגרמה. הפיסגית האדומה מייצגת את הפלואורסצנציה של הדגימה. הפלואורסצנציה של הרקע מוצגת כפיסגית הקרובה ביותר לערך RFU אפס במכשיר זה.
כדי לבטל את הפלואורסצנציית הרקע בערוץ ה-PI, הזז את פס ההחלקת הכחול כדי להתאים את סף הגילוי (threshold). כדי להוציא שיא זה, השתמש בשיא האפור של דגימת הביקורת כנקודת ייחוס. כאשר סף הגילוי בערוץ ה-PI מוגדר כראוי, לחץ על apply כדי לאשר ולחזור למסך הקודם; מכשיר הספירה ינתח מחדש את הנתונים באופן אוטומטי ויעדכן את התוצאות בלשונית הדגימה.
בשלב הבא, כדי לאשר ויזואלית שכל תא שויך כראוי, לחצו על לשונית הזום (zoom), ולאחר מכן בחרו שדה ראייה שצולם לצורך סקירה על ידי לחיצה על התמונה הממוזערת. לאחר מכן, לחצו על לשונית השכבות (layers). בשלב הבא, לחצו על כפתור ה-GFP או ה-PI כדי להציג את התמונה שצולמה דרך ערוץ זה.
לחץ שוב על אותו כפתור כדי להסיר את השכבה מהתצוגה, או כדי להלביש שכבות אחת על השנייה, גע בכפתורים המתאימים לכל ערוץ כדי לזהות כיצד נספרים התאים דרך ערוץ מסוים. מעגלים המקיפים תאים שנספרו רק דרך ערוץ השדה המואר (bright field), אשר אינם מבטאים פלואורסצנציה, יופיעו בצבע כחול. הדבר מעיד על כך שתא מסוים הוא תא חי המבטא סימן בערוץ הירוק.
תאי GFP יסומנו במעגל ירוק כאשר הם מתבטאים בערוץ האדום. תאים שצבעו ב-pi יסומנו במעגל אדום והם תאים מתים שנספרים בשני הערוצים. תאים המופיעים בערוץ האדום והירוק יסומנו במעגל צהוב.
דבר זה מעיד על כך שהתא מבטא GFP אך נצבע גם ב-pi ולכן הוא מת. מדי פעם יופיע עיגול שחור על המסך. אלו הם אובייקטים שזוהו אך הוצאו מהניתוח על בסיס גודל התא.
המשיכו לדייק את סף החיתוך בהיסטוגרמת הפלואורסצנציה באמצעות השלבים שתוארו זה עתה, עד שכל תא המבטא פלואורסצנציה יסומן במעגל בצבע המתאים. כל פרמטרי הניתוח נשמרים באופן אוטומטי במכשיר, תחת לשונית הנתונים (data tap).
המונה יכול לאחסן קבצי נתונים מ-500 הרצות דגימה. כל קובץ המאוחסן בלשונית הנתונים (data) זמין לניתוח חוזר. על ידי בחירת הקובץ מלשונית הנתונים, הוא ייפתח מחדש וכל ההיסטוגרמות והשכבות יהפכו לפעילות לצורך ארכוב נתונים והפקת דוחות.
ניתן להעביר את הנתונים המאוחסנים במכשיר למחשב באמצעות התקן USB. ארבעה סוגי תאים מייצגים הועברו באמצעות קונסטרוקט ויראלי של GFP, חלבון פלואורסצנטי המכוון לגרעין התא, ונצבעו בערכת tally viability באמצעות ריאגנט dead cell red, ולאחר מכן נותחו באמצעות tally בציטומטר זרימה כפי שמוצג כאן. שתי השיטות דיווחו על אחוז דומה של האוכלוסייה עבור כל סוג תא שהביע GFP, לצד אחוז האוכלוסייה הכולל שהיה גם חיוני וגם מבטא GFP.
נתונים אלו מדגימים כי הציטומטר Tali מסוגל להבחין בין ביטוי GFP כולל באוכלוסייה לבין ביטוי GFP באוכלוסיית התאים החיים. הדגמנו כעת כיצד להשתמש בציטומטר Tali מבוסס תמונה כדי להעריך ביטוי פלואורסצנציה וחיוניות בדגימת התאים שלכם. טכנולוגיה זו מגשרת על הפער בין מחקרי תאים בודדים למחקרי אוכלוסיות תאים.
באמצעות הציטומטר המבוסס על דימות של tally, ניתן לאסוף מידע חזותי כמותי ואיכותי על תאים בודדים וכן על אוכלוסיות תאים גדולות יותר. באמצעות אותו הליך, ניתן לבצע מספר בדיקות נוספות, כולל אפופטוזיס, ביטוי RFP וחיוניות תאים. עבור תאים שאינם מבטאים, היישומים הפוטנציאליים כוללים הערכת ביטוי גנים ועד למחקרים על יעילות תרופות.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע בדיקות חיוניות תאים וביטוי פלורסצנציה באמצעות ה-Tali Image-Based Cytometer. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לנתח אוכלוסיות תאים באמצעות נתונים כמותיים וויזואליים כאחד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- ציטומטריה
רקע
- הציטומטר מבוסס התמונה Tali מהווה חלופה לציטומטריה זרימה מסורתית.
- הוא מאפשר רכישה סימולטנית של נתונים כמותיים וחזותיים.
- השיטה ידידותית למשתמש וכלכלית.
- היא מתאימה לניתוח תאים המבטאים GFP.
מטרת המחקר
- להערכת חיוניות תאים בתאים המבטאים GFP.
- להדגמת היתרונות של ציטומטריה מבוססת תמונה על פני שיטות מסורתיות.
- לספק פרוטוקול מפורט לשימוש בציטומטר מבוסס תמונה מדגם Tali.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנסדוקציה של תאי U2 OS עם GFP.
- צביעה באמצעות ריאגנט Tali Dead Cell Red.
- טעינת דגימות לתוך שקפיות ניתוח תאי Tali.
- שימוש בציטומטר מבוסס תמונה של Tali לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- נתונים כמותיים על חיוניות תאים וביטוי GFP.
- ייצוג חזותי של אוכלוסיות תאים.
- היסטוגרמות המציגות את גודל התאים ואת עוצמת הפלואורסנציה.
- השוואת תוצאות עם ציטומטריה זרימה מסורתית.
מסקנות
- הציטומטר מבוסס התמונה של Tali יעיל להערכת חיות תאים.
- הוא מספק תובנות חזותיות נוספות לגבי אוכלוסיות תאים.
- השיטה נגישה לשימוש על גבי שולחן המעבדה במסגרות מחקר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הציטומטר מבוסס התמונה Tali מגשש את הפער בין ציטומטריה של זרימה לבין מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, בכך שהוא מספק נתונים כמותיים וחזותיים בו-זמנית עבור בדיקות חיוניות תאים וביטוי GFP. יכולת פלט כפולה זו תומכת בתהליכי עבודה בשלבי הגילוי המוקדמים, שבהם אישור פנוטיפי והפחתת סיכונים מכניסטים דורשים הן מדדים ברמת האוכלוסייה והן ויזואליזציה של תאים בודדים. העובדה שהמכשיר מונח על שולחן העבודה, עלותו הנמוכה ותפעולו הפשוט מאפשרים שימוש מבוזר בקרב צוותי ביולוגיה של גילוי ופיתוח בדיקות, ובכך מפחיתים את התלות במעבדות מרכזיות ומאיצים קבלת החלטות לגבי המשכיות (go/no-go) בקווי תיקוף של מטרות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי הצלבת ביטוי GFP עם מצב החיוניות באוכלוסיות של תאים חיים.
- ערך תפעולי: מספק אישור ויזואלי ליעילות הטרנספקציה ולמיקום החלבון לצד קריאות כמותיות של חיוניות.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון ביעד על ידי הבחנה בין ביטוי GFP כולל לבין ביטוי בתאים חיוניים, ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: יוצר היסטוגרמות סטנדרטיות לגודל התא, פלואורסצנציית PI ועוצמת GFP, מה שמאפשר ביצוע gating מבוסס סף (threshold) לצורך ניתוח עקבי של האוכלוסייה.
- סקילביליות: מעבד אלפי תאים לדגימה עם דימוג ואנליזה אלגוריתמית עקביים, ובכך תומך בקמפיינים של סריקה בתושבה בינונית.
- שילוב בזרימת העבודה: התוצאות תואמות לניתוחים המשכיים לבחירת מועמדים (hits) ואופטימיזציה של מובילים (leads) בסריקה פנוטיפית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על עקביות הבדיקה משלב תיקוף הגילוי ועד למודלים פרה-קליניים, על ידי אספקת נתוני חיוניות וביטוי בני sammenה לציטומטריה זורמת.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: שכבה ויזואלית של אותות בשדה בהיר, GFP ו-PI מאשרת קולוקליזציה של ביטוי הגן המעובּר ומוות תאי, ובכך מבהירה את מנגנון הפעולה.
- ביטחון ניבוי: מאפשרת קבלת החלטות מותאמות סיכון להמשך התקדמות, על ידי כימות חלקם של תאים חיים המבטאים את הגן המעובּר באוכלוסיות הטרוגניות.
שילוב צינורות עיבוד וזרימת עבודה
הציטומטר Tali משתלב ברצף הגילוי החל משלב תיקוף המטרה המוקדם ועד לזיהוי מובילים, כאשר הערכה סימולטנית של חיוניות ותאי גן דגלי (reporter gene) מספקת מידע על השפעות התרכובת על בריאות התאים ועל המעורבות במטרה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי קישור פעילות של נשאי GFP להישרדות תאים, ובכך מבהיר השפעות של יעד (on-target) לעומת השפעות חוץ-יעד (off-target).
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות של פלואורסצנציה וחיוניות עם תיקוף חזותי, מה שמשפר את השחזור של הבדיקה ואת אישור הפגיעות (hit confirmation).
- אנליטיקה: מספק קריאות מבוססות היסטוגרמה עבור גודל התא, עוצמת GFP ועוצמת PI, מה שמאפשר השוואה סטטיסטית בין תנאים וחזרות.
- מחקר תרגומי: מבטיח המשכיות של נתונים עם זרימות עבודה פרה-קליניות על ידי שיקוף של תוצרי ציטומטריה של זרימה, תוך הוספת הקשר חזותי לפירוש מכניסטי.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמת מעבדה משותפת לבדיקות מרובות (חיוניות, ביטוי GFP/RFP, אפופטוזיס), ובכך ממקסם את ניצול המכשיר על פני פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות נתונים ויזואליים וכמותיים מתואמים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של ביצוע הבדיקה באמצעות שקופיות חד-פעמיות וניתוח תמונות אוטומטי, מה שמשפר את השחזוריות ומפחית את השונות בין המשתמשים.
- ערך אסטרטגי: מאיץ את לוחות הזמנים של הגילוי על ידי אפשור איטרציות מהירות על שולחן העבודה, ללא מגבלות תזמון של ציטומטריה זרימה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מבוסס סיכון על ידי כימות תאים חיים וחיוביים לטרנסגן, ובכך משפר את איכות המועמדים להמשך התהליך.
שיקולי יישום
- נדרש הדרכה בסיסית בעקרונות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ובקביעת ספי thresholds (גating) עבור פרמטרי פלואורסצנציה ופיזור (scatter).
- תלוי בשימוש ב-Tali Image-Based Cytometer, ב-Tali Cellular Analysis Slides, וב-Tali Viability Kit - רכיב Dead Cell Red לזיהוי חיוניות מבוסס PI.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי צביעה, זמני דגירה ונהלי מיקוד בין משתמשים ואתרים שונים כדי להבטיח תוצאות עקביות.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של ריכוז התאים ותנאי הצביעה, בשל הבדלים בגודל ובפלואורסצנציה עצמית (autofluorescence).
- מגבלות מעשיות כוללות חוסר יכולת לבצע אימונופנוטיפיקה רב-פרמטרית מעבר לשלושה ערוצים, ואי-תאימות לבדיקות של תאים דבקים ללא ביצוע דיסוציאציה.
