קביעת פעילות ציטוטוקסית אופטימלית של CD8 תאי T ספציפי אדם Her2neu על ידי השוואת Assay שחרור Cr51 למערכת xCELLigence

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע את פעילות תאי T ציטוטוקסיים על ידי השוואה בין גישה מבוססת עכבה (impedance) באמצעות מערכת ה-EXOGEN לבין בדיקת שחרור כרום. השלב הראשון מבוצע על ידי הפרדת תאים מונונוקליאריים מדם פריפרי (PBMC) מדם מלא באמצעות fial. לאחר מכן, מוסיפים את ה-PBMC לבארות יחד עם אנטיגן פפטידי, IL-2 רקומביננטי אנושי, ו-PBMC שהקרנו כדי ליצור תאי T CD8 ספציפיים לאנטיגן.

תאי T מסוג CD8 הספציפיים לאנטיגן מקולטבים לאחר מכן עם תאי גידול בשני הבדיקות כדי לגרום למות תאי הגידול. התוצאות המתקבלות מראות את אחוז הליזת תאי הגידול באמצעות שיטת העכבה (impedance) ובדיקת שחרור כרום. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת שחרור כרום, הוא שהמערכת המבוססת על עכבה אוספת נתונים בזמן אמת ודורשת פחות תאים שאינם נזקקים לסימון כלשהו. עבור פרוטוקול זה, דם מתורמים בריאים נורמליים חיוביים ל-HLA A2 משמש כמקור ל-PBMC או לתאים מונונוקליאריים של דם פריפרי, בהתאם לפרוטוקול היצרן.

השתמשו ב-F call PA plus כדי להפריד את ה-P BMCs מהדם. לאחר מכן, העמיסו למגשים של שש בארות כ-4 מיליון P BMCs ב-2 milliliters של מצע לכל בארה. לכל בארה הוסיפו HLAA two binding peptide לריכוז סופי של 10 micrograms per milliliter בתרבית.

את התאים בימים חלופים כדי לסייע בגירוי והרחבה של תאי T. הוסף מצע טרי מועשר ב-human recombinant IL-2 לריכוז סופי של 50 units per milliliter. לאחר שבוע, הכן תרבית של pbmc אוטולוגיים, הקרן את התאים וחשף אותם למשך שעתיים לאותם hla.

פעפטיד קושר שני בריכוז 10 µg/mL יעורר מחדש את התרבית על ידי הוספה של 1 mL של PBM CS אוטולוגי שהוקרן לכל באר. המשך להוסיף מצע טרי המועשר ב-IL-2 בימים חלופים. לאחר שבוע נוסף, עורר מחדש את התרביות באופן דומה פעם שנייה. לאחר שישה ימים נוספים בתרבית, התאים יהיו מוכנים לשימוש.

הכינו את תחנת מדידת העכבה האינטליגנטית לשימוש על ידי שיווי משקל בטמפרטורה של 37 °C תחת 5% carbon dioxide למשך שעה אחת לפחות. קצרו תאי גידול אנושיים בהשגה של 75% confluence באמצעות 0.25% trypsin וסבב צנטריפוגה. ספרו את תאי הגידול באמצעות המוציטומטר ושחזרו אותם ב-RPMI.

מדיום גידול של תאי גידול בריכוז של 7,500 תאים למיקרוליטר. בשלב הבא, תוכנת ה-Excel agent הגדירה את דף הפריסה (layout) עם סידור הבארות. הגדירו את דף לוח הזמנים (schedule) כך שיילקחו מדידות עכבה בכל חמש דקות למשך תקופה של 40 שעות; במהלך 18 השעות הראשונות, מערכת ה-Xceligent תבצע מדידות עכבה של תאי הגידול בלבד.

לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של מצע גידול גידולי RPMI לכל באר. בצעו מדידת רקע ב-EPLs על ידי מדידת עכבה (impedance) בהיעדר תאים. לאחר הוספת תאי הגידול, הכניסו את הפלטות לתחנה והתחילו בביצוע המדידות.

תאי הגידול יתחילו להיצמד מיד ל-EPLs. לאחר כ-18 שעות של דגירה, תאי הגידול יהיו צמודים ל-EPLs ומספרם יכפיל את עצמו ל-15,000 תאי גידול לבאר. בנקודה זו, קצרו את תאי ה-T המוכנים באמצעות גירוד עדין וסבוב בצנטריפוגה.

יש להחזיר את תאי ה-T למדיום RPMI עם 10% FBS ולספור אותם באמצעות המוציטומטר. לאחר קביעת צפיפות התאים, הכין סדרת מהלולים של תאי ה-T ביחס של פי שניים, כך שכאשר יתווספו 200 µL של תאי T לתאי הגידול, הריכוז הגבוה ביותר יהיה 40 תאי T לכל תא גידול. המהלול האחרון בסדרה צריך לספק 1.25 תאי T לכל תא גידול.

השעה את תחנת ה-EXOGEN והוצא את ה-EPL באמצעות פיפטה. הסר את המצע מהבארות, ולאחר מכן טען 200 microliters של תאי T תוך שימוש בכל הריכוזים מסדרת המיהולים כביקורת שלילית. השתמש במצע טהור, החזר את ה-EPL לתחנה והמשך בתוכנית בסיום הבדיקה.

בצעו נורמליזציה לתוצאות. פעלו תמיד בהתאם לנהלי בטיחות הקרינה המוסדיים בעבודה עם כרום 51 ותאי מטרה המסומנים בכרום 51, והשתמשו במיגון כדי להפחית את החשיפה לקרינה. התחילו בביצוע פולס לתאי הגידול למשך שעתיים בריכוז של 1 million cells per milliliter עם 10 µL per milliliter של כרום 51 טרי.

בשלב הבא, שטפו את תאי הגידול ב-10 milliliters של מצע RPMI עם 10% FBS, סובבו את התאים בצנטריפוגה והחזירו אותם למצע זה בריכוז של 1 million cells per milliliter. לאחר מכן, העבירו לצלחת 96 בארות בעלת תחתית עגולה. הוסיפו 100,000 תאי גידול לכל בארה לצורך חישוב שחרור ספונטני.

אל תוסיפו דבר לשש מבארים אלו ולשש בארים נוספות. הוסיפו 100 µL של Triton X 100 לכל שאר הבארים כדי ללוטץ (lyse) את התאים ובכך לחשב את השחרור המקסימלי. הוסיפו תאי T לצלחת באמצעות סדרת המיהולים שהוכנה קודם לכן.

כעת הדגרי את הפלטות למשך חמש שעות ואספי דגימות של 50 µL מהנוזל העליון (supernatant) מכל אחת; טעני את הדגימות לפלטת luma לאחר ייבוש הפלטות במנדף למשך הלילה בטמפרטורת החדר. מדי את ה-CPM שלהן באמצעות מונה גמא. תאי T ותאי סרטן SKBR3 תורבדו על פלטות X intelligence ונמדד מדד התאים (cell index), המהווה השתקפות של עכבת הפלטה, מכיוון שתאי T אינם דורשים היצמדות כדי להתרבות.

השפעתם על העכבה הייתה זניחה לאורך 40 שעות של תרבית. תאי סרטן שגודלו לבדם הראו עלייה במדידת העכבה. עם זאת, הוספה של תאי T לאחר 18 שעות קוטעת מגמה זו.

אירוע זה דורש נורמליזציה של התוכנה לאחר הוספת תאי T, והוא נחקר בהמשך בניסוי הבא. כאשר תאי SK BR three גודלו בתרבית משותפת עם ריכוזים משתנים של תאי T, נרשמה ירידה בעכבה (impedance) שהייתה תלויה באופן ברור במינון תאי ה-T; נתונים נאספו מדי חמש דקות לאורך שלושה ניסויים בנקודת הזמן של 10 שעות. מדדי התאים (cell indices) עקבו אחר פולינום מסדר שני בטווח של תאי ה-T, מה שמעיד על כך שתחנת ה-Exogen מנטרת בזמן אמת מוות של גידולי SK B three המתווך על ידי תאי CD eight T, כביטוי של ירידה במדד התאים, כדי לקבוע אם הירידה בעכבה של תאי SK BR three על ידי תאי ה-T הייתה ספציפית לאנטיגן.

שלושה תאים מסוג SK KBR בוטייו בתרבית משותפת עם תאי T ספציפיים ל-FLU החיוביים ל-HLA A 2 שאינם מזהים את HER2. לתאים אלו הייתה פעילות ליטית נמוכה באופן משמעותי. כדי לקבוע אם תאי T ספציפיים ל-HER2 פועלים באופן תלוי-אנטיגן, הוסף נוגדן ל-Fas ligand לתרביות המשותפות. הנוגדן לא הפחית את הפעילות הליטית של תאי T הספציפיים ל-HER2 P 360 9.

עם זאת, בתאי T שהופעלו באופן לא ספציפי באמצעות חרוזי anti CD three, CD 28, הנוגדן עיכב את הליזיס, וזאת כדי לקבוע אם ההריגה התרחשה באופן תלוי HLA class one. לתרביות המשותפות (co cultures) הוסף נוגדן anti HLA class one או נוגדן בקרה איזוטיפי (isotype control antibody). התוצאות תמכו באופן נחרץ בהיפותזה זו.

בשלב הבא, תאי T תורגבו בתרבית משותפת עם תאי סרטן אחרים ביחס של אחד לחמישה. קו תאי הגידול BT 20, השלילי ל-HLA A two, שימש כביקורת שלילית. התוצאות מראות כי השיטה יעילה עבור תאי גידול נצמדים ממטרות מרובות.

תרביות מעורבות של שני תאי T ספציפיים ל-P 360 9 חדשים של HER הוספו לתאי מטרה המסומנים ב-chromium 51, ולאחר מכן בוצע ניתוח CRA. נראה כי בדיקת האינטליגנציה רגישה יותר לניתוח עקביות. השונות התוך-בדיקתית חושבה כמקדם השונות באחוזים בכל יחס תאים בין 1:40 ל-1:5.

ערך זה נמדד מתחת ל-15% ביחסי התאים הנמוכים ביותר. עם זאת, אחוז ה-CV היה גבוה או בלתי צפוי. בנוסף, נבחנה השונות של ליזיס תאי SK BR 3 על ידי תרבית משותפת עם שורות שונות של תאי T ספציפיים ל-P 360 9.

הנתונים הופקו במרווחים של 30 ימים. הבדיקות בוצעו בשלוש חזרות והתוצאות היו דומות מאוד. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבנה טובה של אופן קביעת הפעילות של תאי T ציטוטוקסיים באמצעות תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן ותאי גידול, תוך שימוש בגישה מבוססת עכבה (impedance).