איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות ולכמת את מאגר הרעל שנכנס לציטוזול. כדי להשיג זאת, הרעל נקשר תחילה לפני השטח של התא המארח בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן מסירים את הרעל שאינו קשור ומחממים את התאים ל-37 °C, דבר המאפשר תנועה של הרעל אל תוך מערכת הממברנות הפנימית, ובהמשך אל ציטוזול התא המארח. לאחר חדירת הרעל לתאים, נעשה שימוש בדיגיטונין כדי להגמיש באופן סלקטיבי את ממברנת הפלזמה.

תמריתי התאים מופרדים לfracciones ממברנה וציטוזול נפרדות באמצעות צנטריפוגציה דיפרנציאלית. כשלב סופי, משתמשים בresonans פלזמה שטחית (SPR) כדי לזהות ולכמת את כניסת הרעל לציטוזול, באמצעות פרפוזיה של פראקציית הציטוזול מעל חיישן SPR המצופה בנוגדן נגד הרעל. שיטה זו תסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של רעלים, כגון היעילות והקינטיקה של כניסת הרעל לציטוזול, כמות הרעל שנכנסת לציטוזול, ועיכוב תרופתי אפשרי של תעתוע הרעל אל הציטוזול. לפני תחילת פרוטוקול זה, הכינו תאי HeLa להרעלת תאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, לאחר דגירה של תאי ה-HeLa למשך לילה.

החליפו את מצע התרבית ב-1 mL של DMEM המכיל 100 ng/mL של Ganglioside GM1 והדגרימו למשך שעה אחת ב-37 °C. פעולה זו מגדילה את מספר אתרי הקשירה עבור רעלן החולרה, שכן קולטן ה-GM1 של הרעלן ישולב בממברנת הפלסמה של תאים שנחשפו לתמיסת GM1.

לאחר דגירה של שעה אחת, הסיר את המדיום המכיל GM one ושטוף את התאים פעמיים עם DMEM. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של DMEM המכיל מיקרוגרם אחד למיליליטר של cholera toxin, והנח את התאים בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות. הסר את המדיום המכיל את הרעלן ושטוף את התאים פעמיים.

לאחר מכן, דגרו את התאים ב-1 ml של DMEM בטמפרטורה של 37 °C למשך הזמן הרצוי. בסיום כל תקופת מרדף (chase period), שטפו את התאים ב-PBS ולאחר מכן דגרו כל באר עם 250 µL של EDTA בריכוז 0.5 mM ב-PBS. לאחר דגירה של 10 דקות על קרח, הסירו את התאים מהפלטה בעלת שישה בארות על ידי TRI נמרץ באמצעות פיפטמן P1000.

לאחר איסוף התאים מבאר אחת, שלבו אותם עם התאים מהבאר השנייה ולאחר מכן מהבאר השלישית מאותו תנאי. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים המשולב משלוש בארי החזרים לפ menutupל מיקרוצנטריפוגה אחת. כעת, סובבו את נבובת המיקרוצנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה שולחנית למשך חמש דקות.

ב-5,000 ×g יש להפיק משקעי תאים בגודל שווה בקירוב עבור כל התנאים. יש להסיר את הנוזל העליון ולאחר מכן לסבב מחדש את משקע התאים ב-100 µL של תמיסת עבודה 0.04% של digitonin, שהוכנה מראש וקולתה. יש להניח את תרחיף התאים על קרח למשך 10 דקות. באמצעות מיקרו-צנטריפוגה שולחנית, יש לסובב את התאים המאווררים על ידי digitonin ב-16,000 ×g למשך 10 דקות.

העבירו את חלק התסנין (supernatant) המכיל את הציטוזול למבחנה חדשה למיקרו-צנטריפוגה ושמרו את חלק המשקע המכיל את האברונים. תמיסות סטנדרט של רעלן SPR הוכנו בריכוזים של 110, 1 ו-0.1 ng/mL בבופר HCN. דגימות הוכנו על ידי דילול של חלקי התסנין המכילים ציטוזול בבופר HCN לנפח סופי של 1 mL. נפחי דגימה של לפחות 1 mL נחוצים כדי להבטיח שכל האוויר יסולק מלולאת הדגימה בנפח 500 µL לפני ההזרקה. חלקי המשקע המכילים אברונים הושחאו מחדש ב-1 mL של בופר HCN המכיל 1% Triton X 100.

הוספת דטרגנט הכרחית לשחרור מאגר הרעלים העטוף בממברנה. כמו כן, הכין סטים מקבילים של פראקציות ציטוזוליות ופראקציות של organ L עבור ניסוי ביקורת כדי לאשר את מהימנות הליך הפרקציונציה; השעה מחדש את הפראקציה הציטוזולית ב-20 µL של sample buffer בריכוז four x ואת פראקציית ה-organ L ב-120 µL של sample buffer בריכוז one x. הפר נפחים שוויים של כל פראקציה באמצעות sodium ESAL sulfate, poly acrylamide gel electrophoresis ובצע זיהוי באמצעות Western blood analysis כדי להדגים את חלוקתם של חלבון ציטוזולי בפראקציית העילאית (supine fraction) וחלבון ER ממיס בפראקציית המשקע (pellet fraction). להכנת שקף ה-SPR, הגדר תחילה שקף זכוכית מצופה זהב עם מונושכבה המרכיבה את עצמה (self-assembled monolayer) במכשיר ה-SPR.

הפעילו את שקופית החיישן על ידי הזרמת תמיסת E-D-C-N-H-S מעל השקופית למשך 10 דקות בקצב זרימה של 41 µL לדקה. בכל ההזרמות הבאות, נשתמש באותו קצב זרימה. הסירו את בופר ההפעלה E-D-C-N-H-S על ידי שטיפת הפלטה למשך חמש דקות עם PBS המכיל 0.05% 2020.

הפלטה מכילה כעת קשרי MI רהאיביים בעקבות הסרת החסימה על ידי תמיסת E-D-C-N-H-S. לאחר מכן, בצעו פרפוזיה של נוגדן anti CTA מעל שקופית החיישן הפעילה בדילול של 1 ל-20,000 ב-20 millimolar sodium acetate למשך 15 דקות. תיראה ירידה ראשונית ביחידת מדד השבירה, המקוצרת כ-RIU, עקב השינוי ב-pH.

לאחר מכן תהיה עלייה ב-RIU ככל שנוגדנים יילכדו על ידי הקשרי האמידם התגובתיים. בשטח החיישן, הסר את הנוגדנים שלא נקשרו באמצעות שטיפה של חמש דקות ב-PBST. אות ה-RIU הנוצר על ידי הנוגדנים שנלכדו יגיע למישור ויstбилиזציה, ובכך יספק אות בסיס חדש.

כשלב סופי בהכנת השקף, בצעו PERFUSE של ethanolamine בריכוז one molar על גבי שקף החיישן למשך חמש דקות. פעולה זו חוסמת ומנטרלת כל קשרי קישור (tethers) שאינם קשורים שנותרו על שקף החיישן. אות ה-RIU יעלה כדי לבסס קריאת baseline; בצעו perfuse של PBST על גבי החיישן המצופה בנוגדנים למשך חמש דקות.

לאחר מכן, ביצועו פרפוזיה של דגימה ניסויית או סטנדרט של רעלן מעל החיישן למשך 300 שניות. הסר את הליגנד מהבופר ובצע פרפוזיה של PBST מעל החיישן למשך 200 שניות נוספות. כל רעלן שנותר קשור לחיישן מוסר על ידי שטיפה נוספת עם PBST ב-pH 5.0.

פעולה זו תחזיר את האות לקריאת הבסיס הראשונית שלו, ובכך תאפשר עיבוד של דגימה נוספת באותו חיישן. לפני טעינת דגימה חדשה, דחפו כמות קטנה של אוויר דרך לולאת הדגימה כדי להוציא כל שארית נוזל מהדגימה הקודמת. לאחר הרכישה.

ניתן לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת scrubber two, וניתן להשתמש בתוכנת Igor להכנת איורים. רעלן הפרטוסיס הוא רעלן מסוג AB הנע מפני השטח של התא אל הרשת האנדופלזמית (ER) לפני ששרשרת ה-a של PTs one חודרת לציטוזול.

בדיקת התעתוק המבוססת על SPR הצליחה לזהות PTs בציטוזול של תאי CHO מורעלים. לא נוצר אות מהציטוזול של תאים שאינם מורעלים, מה שאישש כי הנוגדן למסייעי PT לא הגיב באופן צולב עם רכיב בציטוזול של המארח.

פרוקציית הציטוזול מתאים שהורעלו בנוכחות felden. גם A נכשל ביצירת אות חיובי, BFA מונע את הובלת הרעל לאתר התעבורה של ה-ER, ובכך מונע את העברת שרשרת H לציטוזול. Chole toin הוא רעל נוסף מסוג AB המועבר דרך ה-ER.

CTA one זוהתה בפרקציה הציטוזולית מתאי helo שטופלו ב-CT. דבר זה הדגיש כי המתודולוגיה עובדת עם סוגי תאים מרובים וניתן להחילה אותה על כל רעלן שעבורו זמין נוגדן נגד שרשרת. לא זוהה אות כאשר הפרקציה הציטוזולית מתאים שטופלו ב-CT הועברה מעל חיישן SPR מצופה בנוגדן anti CTB, ובכך הוכח כי בניגוד לתת-היחידה CT A one, הפנטמר CTB הנקשר לתא אינו חודר לציטוזול.

בעקבות הזרמה על חיישן SPR המצופה בנוגדן anti CTA. האות מחלקון האבניקים (organelle fraction) הוא מחוץ לקנה המידה בהשוואה לאות החלש יותר מחלקון הצייטוסול. ממצא זה עולה בקנה אחד עם חוסר היעילות המוכר של הובלת CT לאתר התעבורה של ה-ER, אשר בתורו מגביל את כמות הרעלן שיכולה להגיע לצייטוסול.

ניתן גם לנטר את הצבירה התלויה בזמן של רעלן ציטוזולי שהועבר. לאחר חשיפת התאים ל-CT בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, לא זוהה רעלן בציטוזול 15 דקות לאחר חימום ל-37 מעלות צלזיוס.

מאגר קטן של רעלן ציטוזולי זוהה לאחר 30 דקות ב-37 °C, וכמויות גדולות יותר של רעלן ציטוזולי זוהו לאחר פרקי מרדף של 45 ו-60 דקות. הדבר מעיד על הובלה מתמשכת וארוכת טווח של רעלן הקשור לתא אל הציטוזול המארח. הבדיקה יכולה לזהות גם את עיכוב העברת הרעלן אל הציטוזול; תאים שטופלו ב-10% DMSO הראו רמות נמוכות של רעלן דמוי ציטוזול CT1 בהשוואה לתאי ביקורת מורעלים שלא טופלו, דבר המעיד על עיכוב של פריסת הרעלן.

שרשרת היא תנאי מוקדם לתעתוק אל הציטוזול, ולכן ייצוב של CT A1 המושרה על ידי DMSO מנע בהתאם את תנועתו מה-ER אל הציטוזול. כדי לכמת את חסימת התעתוק של הרעלן המושרית על ידי DMSO, נעשה שימוש בעקומת סטנדרט שנוצרה מריכוזים ידועים של הרעלן כדי לחשב ריכוז ציטוזולי של CT A1 של 0.3 nanograms per milliliter עבור תאים לא מטופלים, ו-0.1 nanograms per milliliter עבור תאים שטופלו ב-DMSO. עיכוב פתיחת המבנה של CT A1 על ידי DMSO הוביל, לפיכך, להפחתה פי שלושה בתעתוק של CT A1 מה-ER אל הציטוזול.

בעקבות הליך זה, נוכל להשתמש בטכניקות אחרות, כגון בדיקות רעילות, כדי לבסס קשר ישיר בין כמות הרעל שנמצא בציטוזול לבין פעילות הרעל.