הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית
20 במרץ 2012
כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של אתנול הנזק הנגרמת התפתחותית, פיתחנו מודל של דג הזברה חשיפה אתנול בוחנים את פיזיים, שינויים הסלולר, וגנטיים המתרחשות לאחר החשיפה אתנול 1. לאחר מכן, אנו מבקשים למצוא התערבויות פוטנציאליות במהירות לבדוק אותם במודל בעלי חיים.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור את ההשפעות של חשיפה לאתנול על דגי זברה בשלבי התפתחותם. מטרה זו מושגת תחילה על ידי חשיפת דגי זברה למנות אתנול במי עוברים רגילים במהלך ההתפתחות המוקדמת. לאחר מכן, האתנול מוסר והדגים מורשים להתפתח עד לנקודת הזמן הרצויה.
לאחר מכן, נבדקים הן שינויים פיזיים גסים והן שינויים בביטוי גנים בעוברים שעברו טיפול בהשוואה לעוברי ביקורת. לבסוף, העוברים מטופלים באמצעות mRNA, מורפולינואים או תרופות כדי לקבוע אם ניתן לשנות את הפגמים ההתפתחותיים שהושרה על ידי אתנול. בסופו של דבר, שילוב של qPCR והibrדיזציה in situ מעיד כי השפעות האתנול על עוברי דג הזברה המתפתחים קשורות לשינוי בביטוי גנים.
מניפולציה מאוחרת של רמות ביטוי הגנים עשויה לשפר או למנוע פגמים התפתחותיים המושרים על ידי אתנול. הטכניקות שאנו מדגימים היום מרחיבות את הידע שלנו על טבעה של תסמונת אלכוהול עוברית, וכן משמרות תהליכי התפתחות בחולייתנים. סטף ארהרדט, טכנאית במעבדה שלי, תדגים היום כיצד לטפל בעובריים באמצעות אתנול.
גדלו אותם מהשבחות של סוג בר (wild type) עד לשלב הכיפה (dome stage) בטמפרטורה של 28 degrees Celsius במי עוברים. חלקו את העוברים מתוך תפריקה למספר המנות המבוקש של צלחניות, כאשר בכל צלחנית יהיו בין 10 ל-50 עוברים. הוסיפו לעוברים תמיסת אתנול בריכוז של 0.2 עד 2.5% volume to volume במי דגים, והחזירו למדגרה למשך עד 24 שעות לאחר משך החשיפה הרצוי.
החליפו את האתנול המכיל מים במי עוברים טריים למשך תקופה מוגדרת של התפתחות, כדי לאסוף mRNA עבור qPCR כמותי. העבירו עוברים תואמים של H למבחנות אפלורון. הסירו את מי הדגים והוסיפו תמיסת ליזיס עם TCEP.
באמצעות דחליף (pulverizer) ממונע, הפרד פיזית את העוברים ולאחר מכן העבר אותם לצנטריפוגה לסבב איטי. העבר את התמיסה לעמודת ניקוי מקדימה (pre-clear column), ואז צנטריפוג את העמודה, כדי להסיר חלקי רקמה גדולים שהופרדו.
השתמשו בערכה לבידוד RNA כדי להפיק את ה-RNA. לאחר מכן, סנתזו cDNA בשיטות סטנדרטיות עבור ניתוח QPCR או microarray כדי להכין את העוברים עבור היברידיזציה במקום (in situ hybridization) וסימון נוגדנים. קבעו עוברים שגילם שש עד 24 שעות לאחר ההפריה ב-4% paraformaldehyde למשך לילה בטמפרטורה של 4°C, לאחר שלושה שטיפות ב-PBS פלוס 0.1% tween.
הסיר את ה-choon באמצעות שתי פינצטות חדות תחת המיקרוסקופ. לאחר מכן, העבר את העובריים למתנול באמצעות סדרת החלפות נוזלים עם ריכוז מתנול עולה וריכוז PBT יורד. לאחר העברת העובריים ל-100% methanol, אחסן אותם בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לצביעת הסחוס.
גדלו את העוברים עד לחמישה או שישה ימים לאחר ההפריה. קבעו אותם למשך הלילה ב-4% paraformaldehyde בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים ב-PBT כדי לקבוע אילו רמות ביטוי של גנים השתנו כתוצאה מחשיפה לאתנול.
בצעו QPCR על ידי תכנון ראשוני של פריימרים ולאחר מכן תיקוף שלהם. בחנו אותם על שלוש דגימות ביולוגיות. דגימות ביקורת ביולוגיות אלו יכולות להיות מכל גיל, כל עוד הגן הרלוונטי מובע בגיל ספציפי זה.
לאחר אימות הפריימרים, השתמש ב-CDNA שהוכן מראש כדי לבצע QPCR, כאשר הדגימות מורצות בשלוש חזרות וכוללות דגימת בקרה עבור בקרה של zebrafish; אנו משתמשים בפריימרים כדי למדוד gap dh. נרמל את התוצאות לרמות של gap DH. לאחר מכן, חשב את רמת הביטוי הגנית היחסית באמצעות שיטת ה-powerful method.
וריאציה של שני delta delta CT המציגה את ההבדל בין הניסוי לסוג הברא (wild type). עבור C, שני מבני היברידיזציה. גש probes של ribo המסומנים לגן המדובר.
לאחר מכן, דגרו אותם עם עוברים בעלי גיל תואם בתנאים סטנדרטיים וזהו את דפוס ההכלאה (hybridization) באמצעות פוספטאזה עיקורית (alkine phosphatase); צלמו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה כדי להעריך את ההתפתחות המורפוגנית, כגון צורה של עיניים. צלמו עוברים חיים כדי להעריך את המרחק הבין-עיני ואת אורך הגוף. ראשית, קבעו את העוברים בפרה-פורמאלדהיד. לאחר מכן, אספו תמונות כדי לבחון את השפעות הטיפול באלכוהול על מבני הסחוס המתפתחים בזחלים שנסמנו.
קבעו את דגי הזבראפיש באמצעות lc וכחול למשך מספר שעות עד ללילה כדי להקשיר ולהבהיר את העוברים לפני הדמיה. נתחו מוות תאי בעוברים חיים על ידי דגירה שלהם ב-5 mg/mL של aine orange ב-PBS למשך שעה אחת. שטפו את העוברים שלוש פעמים ב-PBS, לאחר מכן קיבעו את העוברים על למסות, הדמיעו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי והשתמשו ב-Z series ליצירת תמונות מורכבות (composites).
לאחר זיהוי גנים שביטוים פחת כתוצאה מחשיפה לאתנול, מזריקים 25 עד 200 picograms per nanoliters של mRNA חסום (capped) עבור הגן הנבחר לשלב של תא אחד עד שניים. מאפשרים לביציות להתאושש באינקובטור המחומם ל-28 °C עד להגעתן לשלב הכיפה (dome stage), ולאחר מכן מטפלים בהן באתנול כפי שנעשה קודם לכן. עבור גנים שביטוים עלה כתוצאה מחשיפה לאתנול, מבצעים השתקה (knock down) על ידי הזרקת כמויות של picogram עד nanogram של antisense morphos לעוברי שלב של תא אחד עד שניים.
פרוטוקול זה דומה לזה של mRNA בעל כיסוי (capped mRNA). אם מזריקים mRNA או morpholino שגורם לשחלוף (splicing morpho), יש למדוד את היעילות באמצעות R-T-P-C-R כדי להשוות את כמויות התמלילים שעברו שחלוף ואלו שלא, זאת במטרה לנתח את פעילות הגן התלויה במינון. יש לבצע טיטרציה של ה-morpholino המוזרק ולאפשר לעוברים להתפתח לשלב הרצוי לפני הטיפול בהם באתנול. חשיפת עוברי דגי זהב לאתנול מובילה למספר פגמים התפתחותיים וגנטיים הקשורים לפנוטיפים הנמצאים בחולייתנים אחרים.
התפתחות לא תקינה של רקמות ציר, כולל Noor, מובילה ל-noord מקוצר ולעיתים קטוע, מה שמוביל בחלקו לליקויים מאוחרים יותר בסומייטים כפי שמוצג כאן. בעוד שבביקורות שלא טופלו נראה מבנה חזק בצורת V (chevron), הסומייטים שטופלו באתנול מקבלים מראה בצורת U, הנראה כאשר ישנה סיגנליזציה מופחתת של sonic hedgehog. כפי שניתן לראות כאן.
השלכה נוספת של חשיפה לאתנול, שייתכן שהיא תוצאה של עיכוב התפתחותי מוקדם ופגמים עוקבים ב-Noor, היא קיצור של אורך העובר. ממצא זה דומה להתמדת מצב של טרום-בגירות וקומה נמוכה הנמצאים בילדים שנחשפו לאתנול במהלך ההתפתחות, דבר המצביע על כך שדגם דג הזברה רלוונטי להבנת מום מולד זה בבני אדם. הוכח במודלים של בעלי חיים כי חשיפה חמורה לאתנול מובילה לפנוטיפים בולטים של תסמונת אלכוהול עוברית, כולל synthia ו-opia.
בדגי zebrafish, המרחק הבין-עיני (intraocular distance או IOD) קטן באופן התלוי במינון האתנול, באופן העולה בקנה אחד עם טבעו של הפגם המולדי באדם. אופיה (Opia) נמצאת רק במינונים גבוהים מאוד, אך מינונים נמוכים יותר גורמים להפחתה משמעותית ב-IOD, מה שמעיד על כך שדגם חיה זה סובל מפגם דומה בהתפתחות קו האמצע של הפנים. באיור זה, רמות הביטוי הגני המוקדמות של six three B ו-glee one מושוות בעוברים שלא טופלו ובמול עוברים שטופלו באתנול.
שני הגנים הראו רמות ביטוי מופחתות בדגימות שטופלו באתנול. באמצעות כריזליזציה כפולה של NC, נותחו דפוסי הביטוי עבור six3B ו-gooID כפי שניתן לראות. כאן, שני הגנים הראו ירידה בביטוי המרחבי בעוברים שטופלו באתנול בהשוואה לבי controls לא מטופלים.
מכיוון ששני הגנים מובעים ברקמות שנועדו להפוך לרקמות קו האמצע הקרניו-פציאליות, הפחתתם שמונה שעות לאחר ההפריה עולה בקנה אחד עם הפחתתו של IOD בשלב מאוחר יותר של ההתפתחות. לאחר זיהוי הגנים המושפעים מאתנול, קיימים מנגנוים שבאמצעותם ניתן להגביר או להפחית את ביטויים. בדוגמה זו, הוזרק mRNA עבור sonic hedgehog, ליגנד המגביר את רמות ה-glee one, ובכך הוא הציל מהפגמים הגסים שנבעו מהפחתה ב-glee one ומהטיפול באתנול בעוברים.
עם זאת, הזרקה של six three B לא הצליחה להציל את הפנוטיפ שנחשף לאתנול. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחקור את הפגמים הגנטיים וההתפתחותיים שנגרמו על ידי אתנול בעובר דג זברה בתהליך התפתחות. ניתן ליישם את הטכניקות שנעשה בהן שימוש כאן גם על אלו המעוניינים לחקור את הרעילות של תרכובות מסיסות במים אחרות בעובר חולייתים בתהליך התפתחות.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את ההשפעות של חשיפה לאתנול על דגי זברופיש בשלבי התפתחות, תוך התמקדות בשינויים פיזיים, תאיים וגנטיים. מטרת המחקר היא לזהות התערבויות פוטנציאליות להפחתת נזקים התפתחותיים המושרים על ידי אתנול.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- רעילות
רקע
- חשיפה לאתנול במהלך ההתפתחות עלולה להוביל למומים משמעותיים.
- דגי zebrafish משמשים כאורגניזם מודל לחקר השפעות אלו.
- הבנת השינויים בביטוי הגנים היא קריטית לזיהוי התערבויות.
- תסמונת אלכוהול עוברית היא תחום דאגה מרכזי בתהליכי התפתחות.
מטרת המחקר
- לבחון את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס נזקים התפתחותיים המושרים על ידי אתנול.
- להעריך שינויים פיזיים וגנטיים בעוברים של דגי זבראפיש.
- לבחון התערבויות פוטנציאליות שעשויות למנוע או להפחית השפעות אלו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- עובריים נחשפים לריכוזים משתנים של אתנול במהלך ההתפתחות המוקדמת.
- ביטוי גנים מנותח באמצעות quantitative PCR והibridization in situ.
- מבצעים מניפולציות בעוברים באמצעות mRNA, morpholinos או תרופות כדי להעריך את יעילות ההתערבות.
- שינויים פיזיים ושינויים בביטוי גנים מושווים בין קבוצות הטיפול לקבוצות הביקורת.
תוצאות עיקריות
- חשיפה לאתנול גורמת לפגמים התפתחותיים הדומים לאלו הנראים בתסמונת אלכוהול עוברית.
- שינויים בביטוי גנים נמצאים במתאם עם הפרעות פיזיות בעוברים של דגי זברפיש.
- התערבויות המכוונות לביטוי גנים עשויות לשפר את התוצאות עבור עוברים שנחשפו לאתנול.
- הממצאים תורמים להבנת ההשפעה של אתנול על התפתחות חולייתנים.
מסקנות
- מודל דג הזברה מדגים ביעילות את השפעות האתנול על ההתפתחות.
- זיהוי שינויים בביטוי גנים הוא קריטי לפיתוח התערבויות.
- מחקר זה מעמיק את הבנתנו לגבי תסמונת אלכוהול עוברית והמנגנונים שלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה כמותית של השפעות טרטוגניות בעוברי דג זברה החשופים לאתנול מאפשרת הפחתת סיכונים בשלב מוקדם עבור רעילות התפתחותית של תרכיבים מועמדים. מודל זה מספק ביטחון חיזוי בזיהוי שינויים בביטוי גנים ונקודות קצה מורפולוגיות הרלוונטיות להפרעות ספקטרום אלכוהול עוברי בבני אדם. שילוב פלטיים אלו בתהליכי גילוי תומך ברצף תרגומי ובקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח המותאמות לרמת הסיכון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מנגנוני רעילות התפתחותית באמצעות ניתוח ביטוי גנים וניתוח פנוטיפי.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות מועמדות המעורבות במסלולים טרטוגניים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור שינויים מולקולריים לפגמים התפתחותיים ניתנים לצפייה.
- מספקת פלטפורמה למיון תרכובות על בסיס אותים מוקדמים של בטיחות בשלב הפיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מגדיר בדיקת עוברים של zebrafish הניתנת לשחזור לצורך סריקת טרטוגניות של תרכובות מסיסות במים.
- מספק תוצרי מדידה כמותיים, כגון מרחק בין העיניים ומורפולוגיה של הסומריטים, לקבלת תוצאות סטנדרטיות.
- מאפשר התרחבות (scalability) לצורך הערכה מקבילה של תרכובות ובדיקת התערבויות.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובשחזור בין מחקרים באמצעות פרוטוקולי חשיפה ומדידה מוגדרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נקודות קצב התפתחותיות לפנוטיפים של תסמונת האלכוהול העוברית בבני אדם לצורך רלוונטיות תרגומית.
- מאפשרת זיהוי של סמנים ביולוגיים על ידי קורלציה בין שינויים בביטוי גנים לתוצאות מורפולוגיות.
- תומכת ברציפות משלב הגילוי ועד להערכת בטיחות פרה-קלינית עבור רעלנות התפתחותית.
- מספקת ערך ניבוי לסיכון בבני אדם על ידי מידול תהליכים התפתחותיים שמורים בחולייתנים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מודל זה של דגי זברה (zebrafish) משתלב ברצף השלבים מגילוי ועד לשלב הפרה-קלניני להערכת רעילות התפתחותית ותיקוף מטרות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על מנגנונים טרטוגניים ותפקוד גנים בהתפתחות חולייתנים.
- סינון: מספק נקודות קצה כמותיות וניתנות לשחזור לצורך מיון תרכובות בשלבים מוקדמים.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של ביטוי גנים ושינויים מורפולוגיים בין קבוצות טיפול לקבוצות ביקורת.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי גילוי לבטיחות פרה-קלינית באמצעות מידול של פגמים התפתחותיים הרלוונטיים לבני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת תרכובות מגוונות והתערבויות גנטיות בביולוגיה התפתחותית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ברעילות התפתחותית ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות טרטוגניות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי אספקת נתונים מוקדמים על בטיחות ומכניקה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של תרכובות בעלות פרופילי בטיחות התפתחותית חיוביים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באמבריולוגיה של דגי זברה ובטכניקות של אנליזה מולקולרית.
- נדרשת גישה לתשתית של דימוג, qPCR והיברידיזציה במקום (in situ hybridization).
- דורש סטנדרטיזציה חוצת-צוותים של פרוטוקולי חשיפה ונקודות קצה למדידה.
- ניתן להתאמה לתרכובות ממיסות במים אחרות ולמניפולציות גנטיות בעוברים של חוליתיים.
- המגבלות כוללות הבדלים תלויי-מין ואת הצורך בבחירה קפדנית של מינון כדי לדמות חשיפות רלוונטיות לבני אדם.
