טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדגים כיצד לזהות באופן מדויק וספציפי מטבוליטים של חנקן חמצני (nitric oxide) בדגימות ביולוגיות. דבר זה מושג תחילה על ידי עיבוד דגימות דם מיד לאחר האיסוף כדי למנוע אובדן של מטבוליטים או היווצרות של ארטיפקטים. במקביל, מבוצע קציר רקמות מהיר ויעיל כדי למזער את ההשפעות של סביבה היפוקסית על מטבוליטים של חנקן חמצני.

טבעות אאורטות נאספות ונתלות באמבט איברים כדי להעריך את התפקוד האנדותליאלי שלהן. יתרה מכך, נעשה שימוש במבחנים ביוכימיים כדי לכמת את רמות הניטראט, רמות הניטריט, והרמות היחסיות של ניטרו-תיולים ומוצרי ניטרוסילציה אחרים ברקמה. באמצעות מבחנים אלו, השוואה נאותה בין חיות ניסוי לחיות ביקורת יכולה לספק מידע בעל ערך על ייצור ומטבוליזם של חמצן ניטריקי.

היתרון המרכזי בשימוש בגישה רב-מערכתית זו על פני שיטות או בדיקות בודדות הוא שהיא מאפשרת תמונה רחבה יותר של ביוכימיה של nitric oxide במערכות איברים מרובות. כך נוכל להתחיל להבין לאילו ממטבוליטים אלו עשויה להיות תועלת פרוגנוסטית או אבחנתית, וכיצד הרפרטואר של מטבוליטים של nitric oxide משקף את היווצרות הזמינות של nitric oxide אנדותליאלי. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן כל שלב בתהליך חיוני לשמירה על שלמות הדגימה.

חלק משלבים אלו אינם ברורים מקריאת סעיף השיטות בכתבי עת טיפוסיים, וזאת בשל הפירוט הדק של איסוף הדגימות והפקת הרקמות. ד"ר Hong Jing, מדען מחקר בכיר במעבדתי, ידגים הליך זה. לצורך פרוטוקול זה, יש להכין אדם או בעל חיים ניסויי לצורך איסוף דם; במקרה של בעלי חיים ניסויים, ייבחנו גם רקמות הגוף שלהם.

ראשית, אספו דם מלא על ידי החדרת מחט בכילול (gauge) 25 לווריד הנבוב התחתון (inferior vena cava). לאחר איסוף של 500 עד 1000 µL, בצעו פרפוזיה לבעל החיים לניקוז שאריות הדם על ידי הזרקת בופר פיזיולוגי דרך שיא החדר השמאלי (apex of the left ventricle), ואפשרו החלפה מלאה של הדם בעוד הדם והבופר יוצאים דרך הווריד הנבוב התחתון. את דם הווריד יש לאסוף למבחנות צנטריפוגה של 1.5 mL המכילות NEM ו-EDTA מיד לאחר האיסוף.

סובב את הדם ב-14,300 RCF למשך שבע דקות לאחר הצנטריפוגציה. שאב את הפלסמה מהמשקע של ה-RBC באמצעות פיפטה והעבר אותה למבחנה נפרדת. הכן את דגימות הפלסמה המבודדות ל-HPLC על ידי הוספה של נפח שווה (יחס של אחד לאחד) של מתנול קר ל-50 µL של דגימת הפלסמה שנאספה.

ערבבו את התערובת במיקסר וורטקס (Vortex) בעוצמה למשך שלוש עד חמש שניות עד שהיא תהיה עכורה. לאחר מכן, סובבו את התערובת בצנטריפוגה ב-14,300 RCF למשך שבע דקות. כדי להשקיע את חלבוני הפלזמה, אספו את הסופרנאטנט למבחנה נפרדת של 1.5 מיליליטר ואחסנו אותו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד הניתוח.

כדי להכין את הפלזמה לאנליזת כימילומניסנציה, קחו את נפח הפלזמה הנותר, שאמור להיות כ-200 עד 400 µL, וחלקו אותו לשני נפחים. הכינו מחצית אחת מהפלזמה על ידי הוספת 10% נפח של סולפיד מוחמצ 5%, והמתינו 10 דקות. דגימה זו מוכנה כעת לאנליזת CLD.

הכינו חצי נוסף מהפלזמה על ידי הוספת 10% נפח של 2% mercuric chloride לאחר חמש דקות. בטמפרטורת החדר, הוסיפו 10% נפח של sulfonamide מחומץ. המתינו 10 דקות נוספות והזריקו דגימה זו ל-CLD בדומה לפלזמה.

ניתן להכין את משקע ה-RBC עבור HPLC ו-CLD לכל אחת מהבדיקות. התחל בערבוב של חלק אחד של משקע התאים עם ארבעה חלקים של תמיסת ליזיס היפוטונית. ערבב את התערובת היטב במכשיר וורטקס עבור בדיקת CLD.

ההכנה של התאים זהה לזו שבוצעה עבור הפלזמה. התחילו בהוספת נפח שווה של methanol. לאחר מכן, ערבבו את התערובת ב-vortex בעוצמה למשך שלוש עד חמש שניות, ולאחר מכן סובבו אותה למשך שבע דקות ב-14,300 RCF.

כעת יש להעביר את supernatant באמצעות פיפט ולהקפיאו בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד לניתוח באמצעות HPLC לקביעת רמות מטבוליטים של nitric oxide ברקמות. ברקמות רלוונטיות מבעלי חיים ניסויים, יש תחילה לאסוף ולהכין את הדם כפי שמתואר בסעיף הקודם; את איסוף הרקמות יש לבצע כרגיל, תוך מתן תשומת לב מיוחדת למהירות וליעילות כדי למנוע מהרקמות להפוך להיפוקסיות. לאחר האיסוף, יש לבצע הומוגניזציה לדגימות הרקמה ביחס של אחת לחמש ב-PBS המכיל N-E-M-E-D-T-A.

לאחר מכן, הכין את הרקמות ההומוגניזיות עבור אנליזות HPLC ו-CLD כפי שתואר בסעיפים הקודמים עבור RBCs. לאחר הרדמה של עכבר בוגר באמצעות דאתיל אתר (dathyl ether) ואישור כי הוא אינו מגיב לצביטה בבהו, בצע תורקוטומיה. חתך בקו האמצע מבוצע מהסטרנום ועד לאזור הפוביס כדי לחשוף את חללי בית החזה והבטן.

בשלב הבא, בצעו פרפוזיה לבעל החיים באמצעות תמיסת Krebs Alite מחומצנת. השתמשו במזרק בכי মাপ 25 gauge כדי להזריק את התמיסה לשיא (apex) של החדר השמאלי, כאשר העלייה הימנית חתוכה כדי לאפשר יציאה של הדם.

לאחר הפרפוזיה, בודדו את אבי העורקים הבטני על ידי חיתוך והסרה של הכבד, הריאות ורקמות אחרות שעלולות לכסות את אבי העורקים. לאחר מכן, החזיקו את הלב בעזרת פינצטה וחתכו את אבי העורקים מהדופן האחורית של בעל החיים באופן עדין. הניחו את הלב ואת אבי העורקים בצלחת פטרי מלאה בקרח.

בצלחון עם תמיסת קרבס (Krebs buffer) קרה. הסר בזהירות על ידי חיתוך וניקוי את השומן ואת השכבה החיצונית (adventitia) מהאאורטה. הימנע מפגיעה באנדותל הפנימי של כלי הדם במהלך הניקוי.

שמרו על קצב חילוף חומרים נמוך באורטות כדי למנוע היפוקסיה, על ידי העברתן למסייד מחומצן וקר (על קרח) מדי חמש דקות. כעת השתמשו בסכין מנתחים כדי לחתוך את האורטה למקטעים בצורת טבעות באורך של שלושה מילימטרים. העבירו את המקטעים לאמבט רקמות בעל ארבעה תעלים ונפח של 10 מיליליטר, המכיל Krebs buffer מחומצן.

באמצעות כפתור המתמר, גרמו מתיחה מוקדמת של 1.5 grams לכל טבעת אאורטלית. על פי ממצאים אמפיריים, 1.5 grams הוא מתח ההתחלה המתאים לתפקוד וזומוטורי אופטימלי.

במכשיר הניטור של העכבר, רשמו את מדידת הכוח באמצעות גשר אוקטלי בעל שמונה ערוצים ותוכנה לרכישת נתונים, אפשרו לטבעות להגיע לשיווי משקל במשך 80 דקות, תוך החלפת התמיכה כל 20 דקות, ולאחר מכן המשיכו בניסוי. לאחר שמתח הרקמה הגיע לשיווי משקל, הוסיפו 100 nanomolar של fennel rine לכל טבעת כדי להשיג התכווצות סוב-מקסימלית. ברגע שמתח הטבעת התייצב ונוצרה רמה קבועה של טונוס, בצעו ניתוח תגובה למינון של אגוניסט אנדותלייאלי כגון acetylcholine.

שלב זה יקבע את ייצור חמצן nitric oxide ואת מידת הרפיית כלי הדם. לאחר בדיקת תגובת המינון לאצטילכולין, שטפו את האמבטיות בבופר Krebs והוסיפו 100 nanomolar של תמצית שומר לכל אמבטיית איבר כדי לכווץ את כלי הדם. לאחר מכן, קבעו שוב את התגובתיות של טבעות השריר החלק למקור חיצוני של nitric oxide, כגון sodium nitroprusside, עם ובלי ODQ, מעכב של soluble guanylate cyclase.

גישה זו תקבע ערך של 100% הרפיה עבור כלי הדם, ותדגים גם את תפקידו החיוני של soluble guanylate cyclase בתיווך התגובה של nitric oxide להרפיה וסקולרית. מכיוון ש-ODQ ימנע הרפיה ל-sodium nitroprusside בתגובה ל-acetylcholine, טבעות אאורטה מעכברי ביקורת בריאים הירפו, בעוד שטבעות אאורטה מעכברים עם endothelial dysfunction הראו הרפיה מופחתת עקב ירידה בייצור של nitric oxide. בדיקות denitrosation ספציפיות לקבוצות בוצעו גם בבעלי החיים שבקבוצת הביקורת באמצעות chemiluminescence של nitrite.

RSNO ו-RNNO זוהו באמצעות בדיקת דניטרוזציה רדוקטיבית. רמות הניטריט וה-r sno נמדדו על ידי חיסור שטחי פסגות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי חמצן nitric הביולוגיה הווסקולרית, כגון כיצד רמות מסחררות של מטבוליטים אלו של חמצן nitric משקפות את הרמות ברקמה, וכיצד מטבוליטים של מחלה משתנים בתנאי מחלה שונים?

קביעת ריכוזי מצב יציב וזמן מחצית חיים של מטבוליטים רלוונטיים אלו של חמצן חנקתי במערכות איברים מרובות ובמהלך הסירקולציה של בעל חיים בודד, תאפשר זיהוי של חתימות מולקולריות ספציפיות של תהליכי מחלה ותסייע לנו להגדיר שיטות טיפול חדשות המבוססות על חמצן חנקתי, אשר יציידו את הקלינאי בביו-מרקרים טובים יותר לחומרת המחלה או להתקדמותה. באופן כללי, אנשים חדשים בתחום חומצה החנקתית יתקשו בכך, מכיוון ששיטות רבות אינן רגישות מספיק כדי לזהות ולכמת את הרמות הנמוכות של מטבוליטי חומצה חנקתית הנמצאים בדגימות ביולוגיות. ראשית, מי שאינו מיומן בתחום עשוי ליצור ארטיפקטים במהלך עיבוד הדגימה, שיובילו לנתונים שגויים ולפרשנות מוטעית של הנתונים.