הדמיה כמותי של שושלת ספציפית חיוג כמו קולטן בתיווך איתות מונוציטים ותאים דנדריטים של דגימות קטנות של דם אנושי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדגים את השימוש בטכנולוגיית זרימת תמונות (image stream technology) לצורך כימות של מנגנונים תאיים בתאי חיסון ראשוניים מקבוצות חולים מוגדרות היטב. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד תאים מונונוקליאריים מדם פריפריאלי או pbmc מדגימות דם שנלקחו מחולים או ממתנדבים בריאים. לאחר הבידוד, התאים מופעלים ולאחר מכן מסומנים פלורוצנטית.

בשלב הבא, התאים ממוקדים באופן הידרודינמי, מעוררים באמצעות אור לייזר ומצולמים בשיטת איסוף תמונה עם השהיית זמן (time delay integration) באמצעות מצלמת CCD. לבסוף, התמונות נרחשות באמצעות ציטומטר זרימה עם זרימת תמונות (image stream cytometer) ומבוצע כימות של NF kappa b.

ביצוע טרנסלוקציה (Translocation) בכל תמונה תאית מתבצע באמצעות תוכנת ideas. בסופו של דבר, ניתן לקבוע את ההבדלים בין כל קבוצת נבדקים באמצעות ניתוח של תרשימי פיזור (dot plots), היסטוגרמות ותמונות תאים. היתרון של זרם התמונות הוא השילוב בין עובדות לאימונופלואורסצנציה.

אנו יכולים לבחון מסלולי איתות תאיים באופן ספציפי לשושלה, ברמת התא הבודד או ברמת האוכלוסייה, וזאת החל מדגימת דם קטנה בלבד. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח מדעיים על ידי מיקום וכמתית של תוצרי ביניים במסלולי האיתות. לדוגמה, ניתן להשתמש בה כדי לחקור התעתקות גרעינית של גורמים שקופים המתווכת על ידי פעילות, או כדי לבחון את השפעות ההזדקנות על הביולוגיה של התא.

חוקר מהמעבדה שלי ידגים את הטכניקה לאחר בידוד תאים חד גרעיים של דם פריפריאלי (pBMCs) שהתקבלו ממתנדבים אנושיים. השביה מחדש את ה-pBMCs שחולצו בריכוז של 3×10⁶ תאים ל-0.6 milliliters של מצע, ולאחר מכן העבר את תרחיף התאים למבחנות של 1.5 milliliter. לאחר מכן, גרה חלק מהתאים באמצעות חומר מפעיל כגון TLR8 agonist R848 המוצג כאן, והדגר את כל התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 עד 60 דקות באינקובטור עם 5% carbon dioxide.

לאחר תקופת הדגירה, השקיפו את התאים למשך חמש דקות ב-500 ×g בטמפרטורת החדר, השליכו את העלייה, סמנו את התאים באמצעות תערובת של נוגדנים שפתיים ספציפיים לשושלאות של מונוציטים או DC למשך 20 דקות ב-4 °C, כולל מבחנות תאים המסומנים בצמדים של צבע בודד שישמשו כבקרי פיצוי (compensation controls). לאחר מכן, קבעו את התאים ב-4% PFA ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה של התאים למשך 10 דקות ב-500 ×g בטמפרטורת החדר, השביחו את ה-pbmc בבופר הקפאה ואחסנו את התאים ב-80- °C עד ליום הניתוח.

הפשיר את התאים במהירות באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C, ולאחר צנטריפוגה להסרת בופר ההקפאה, בצע פרמיליזציה באמצעות 100 µL של BD perm wash buffer. לאחר מכן, סמן את התאים עם נוגדי רכיבי סיגנל תוך-תאיים, כגון נוגדי anti NF kappa BP 65 המוצגים כאן, למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השקעה של התאים, השהה אותם מחדש ב-100 µL של BD perm wash buffer המכיל goat anti rabbit IgG.

Alexa 647 והדגירה את ה-pbmc למשך 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. מיד לפני הדמיון, בצעו צביעה נגדית של התאים בצבע גרעיני; התחילו בהפעלת ה-image stream ולאחר מכן הפעילו את תוכנת ה-inspire. לאחר מכן, לחצו על load default template ובחרו ב-initialize fluidics.

לאחר מכן, לחצו על תפריט גלריית התמונות ובחרו ב-"הכל" (all). כעת לחצו על "הפעל הגדרה" (run set up) כדי להתחיל בצילום החרו지를 ולאחר מכן בחרו בערוץ השדה המואר (bright field). ברגע שחרוזי המהירות (speed beads) פועלים, לחצו על "הפעל הכל" (start all) תחת לשונית הסיוע (assist) כדי לכלת ולבדוק את המכשיר.

לאחר כיול מערכת ה-ImageStream, לחצו על flush, lock and load כדי להטעין את הדגימה הבהירה ביותר למכשיר. לאחר מכן, כווןנו את עוצמת הלייזר כך שלכל flora chrome יהיה ערך פיקסל מקסימלי של כ-104,000 counts כפי שנמדד בגרפי הנקודות (dot plots). לאחר מכן, הגדירו את קריטריוני סיווג התאים.

כעת לחצו על run, acquire כדי לאסוף ולשמור את קובץ נתוני הניסוי. כדי לנתח את קובצי הנתונים, פתחו תחילה את תוכנת הניתוח. צרו קובצי תמונה מפוקסים (compensated) ולאחר מכן בצעו gating לאירועים בעלי עצימות צבע גרעיני נורמלית ויחס גובה-רוחב (aspect ratio) גבוה של צבע הגרעין. כדי להבחין בין תאים בודדים ב-R1 gate לבין פסולת (debris) או אירועים רב-תאוויים, מונוציטים נמצאים בתוך ה-gate עבור תאים חיוביים ל-CD14, ותאים דנדריטיים מיאלואידיים, בעלי ביטוי גבוה של CD11c וביטוי נמוך של CD4 וסממני lin1, נמצאים ב-R3 gate.

לבסוף, השתמש בתוכנת ideas כדי לקבוע את הקולוקליזציה של גורם השעתוק הציטופלזמי NF kappa B עם הצבע הגרעיני. מתאם גבוה של NF kappa B עם הצבע הגרעיני, המעיד על קולוקליזציה של שני הסמנים, בא לידי ביטוי בציון דמיון גבוה ומצביע על מידת הפעילות של התא. ניתן להשוות את אחוז אירועי הדמיון הגבוה בין קבוצות טיפול שונות או אוכלוסיות חולים כדי להעריך את היעילות התפקודית היחסית של התאים באמצעות ideas.

ניתן להשתמש בתוכנה להצגת תמונות של תאים מסגמנטים מרכזיים של היסטוגרמות אוכלוסייה. ImageStream מאפשר ביצוע gating של תתי-אוכלוסיות תאים ישירות מ-pbmc והדמיה של תגובות תאים מאוכלוסיות תאים שעברו gating אך לא מוינו. כאן נמדד כמותית בנקודת הבסיס השפעת סיגנל TLR על לוקליזציה גרעינית של NF kappa BP 65 בתאי myeloid dcs שהם lin one, negative CD four, dim CD 11 C positive.

נצפה אחוז גבוה של תאים לא מעוררים עם גורם השעתוק NF kappa BP 65 בציטופלזמה. לאחר עיבור, נקבע כי לתאים המטופלים יש ציון דמיון גבוה משמעותית של NF Kappa BP 65 עם הצביעה הגרעינית PI, מה שמעיד על כך ש-NF Kappa BP 65 עבר לגרעין התא לאחר העיבור. תמונות דיגיטליות שנאספו בו-זמנית של אוכלוסיות תאים לא מטופלים ותאים שעברו עיבור ב-R 8 48 מראות תאים מייצגים ואת עוצמת המעבר של NF kappa B לגרעין התא. שימו לב לעוצמה חזקה יותר של צביעת NF Kappa B ו-PI בקבוצה שעברה עיבור ב-R 8 48 בהשוואה לתאים הבלתי מטופלים.

השתמשנו בטכניקה זו על תאים מתורמים בגילאים שונים והראינו הבדלים במסלולי הפעלת NF kappa B המתווכים על ידי TLR. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בתוך יום אחד, בתוספת זמן לניתוח תמונות, מה שמאפשר הן מספר תמונות לוקליזציה והן סטטיסטיקה של אוכלוסיות. בנוסף, אנו יכולים לצלם תגובות ישירות ממספר אוכלוסיות תאים ללא הפרדה פיזית. ניתן ליישם את זרימת התמונות (Image stream) באופן רחב על מספר מנגנונים תאיים, והיא אמורה להיות בעלת ערך רב במחקר תרגומי.