בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק תאי אפיתל מתרביות רקמה תלת-ממדיות של תאים מעורבים, וזאת כדי לנתח את השפעותיהם של פיברובלסטים סטרומליים על הביולוגיה של תאי האפיתל. דבר זה מושג תחילה על ידי הקמת תרביות שיתוף (co-cultures) תלת-ממדיות של תאים מעורבים עם סטרואידים. לאחר מכן, הספרואידים מופרדים מתרבית המטריקס כדי לבודד את תאי האפיתל לאחר תרבית השיתוף.

השלב הבא הוא לבצע מעבר (passage) לתאי האפיתל לאחר השלב של תרבית משותפת (co-culture), עד שיהיו מוכנים לאנליזה. בסופו של דבר, ניתן להעריך את השפעות החשיפה לפיברובלסטים בתרבית תלת-ממדית על התנהגות תאי האפיתל באמצעות דימות מיקרוסקופי של התרביות ואנליזה של שלב לאחר התרבית המשותפת. תאי אפיתל, כגון דימות פלואורסצנטי של פלישה למטריקס ומעבר ב-Transwell כפי שמוצג כאן. את הפרוצדורה יעמיד קווין, עמית מחקר מהמעבדה שלי, יום לפני הקמת התרביות המשותפות.

הוציאו את ה-matrigel מהמקפיא והפשירהו על קרח במקרר בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה. ביום הניסוי, הניחו את מצע התרבית על קרח לפחות שעה לפני הערבוב עם ה-matrigel. כדי לדלל את ה-matrigel שהופשר.

הוסיפו לשפופרה סטרילית על קרח חצי מהנפח של מצע H Mac קר מאוד הדרוש לתרבית המשולבת (co-culture). לאחר מכן, הוסיפו לשפופרה את אותו חצי נפח של Matrigel מופשר כדי להגיע לדילול של אחד ለአחד, תוך שמירה על השפופרה על קרח. לאחר מכן, מקמו 50 µL מתערובת ה-matrigel והמצע במרכז של בארות ייעודיות בלוח 24 בארות, והדגרירו את הלוח באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם אוויר לח 5% CO2 למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו 450 µL נוספים של תערובת מצע matrigel לבארות והד기로 לדגירה למשך 60 דקות נוספות. במהלך הדגירה השנייה, הכינו תגסוס ביחס של אחד לאחד של פיברובלסטים ותאי אפיתל בריכוז של 0.5 × 10⁵ תאים בכל 0.5 mL של מצע H me. כאשר תערובת מצע ה-matrigel התגבשה, טפטפו בעדינות את תגסוס התאים על גבי הג'ל והחזירו את התרבית למדגירה למשך יומיים.

החליפו את המצע בכל יומיים עד שלושה ימים על ידי שאיבה עדינה מאוד של המצע מצד הבאר והחלפתו בעדינות במצע HEC טרי. עקבו מדי יום אחר היווצרות הספרואידים תחת המיקרוסקופ, וצלמו במידת הצורך באמצעות מיקרוסקופיה של אור או פלואורסצנציה. התחילו בהעברה של התרבית למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפט זכוכית סטרילית של 2 mL. לאחר מכן, העבירו את התרבית בעזרת פיפט הזכוכית לפח צנטריפוגה סטרילי של 15 mL וסובבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-350 ×g בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, הספרואיד התאי ישקע לתחתית הפח.

השתמש בקצה של פיפט פסטור סטרילי כדי להסיר בעדינות את ג'ל המאטריקס המפורק מחלקו העליון של הצנטריפוגה. הכנה. כעת הוסף 1 mL של מצע H mac למשקע, בצע ערבוב על ידי שאיבה והזרקה (pipetting) פעמיים עד שלוש פעמים באמצעות פיפט זכוכית סטרילי של 2 mL, והעבר את התרבית לבאר בצלחת תרבית רקמות של 24 בארות. אפשר לסטרואידים להיצמד למצע למשך 48 שעות לפחות לפני החלפת המצע.

עם הזמן, התאים יעזבו את המבנה הספרואידי ויגדלו כשכבות מונו-שכבתיות (monolayers). לאחר שתרביות התאים הגיעו ל-50% Confluence, העבירו אותם באמצעות פרוטוקול סטנדרטיזציה לצלחנית של 35 מילימטר למשך יומיים עד ארבעה ימים, ולאחר מכן העבירו אותם לצלחנית של 100 מילימטר למשך שלושה עד חמישה ימים לפני ניתוח נוסף של התאים. השתמשו בפיפט פסטור סטרילי כדי לשאוב את המצע ולאחר מכן הסירו ידנית כמה שיותר שאריות של ספרואידים. בתרביות שיתוף (co-cultures) של ספרואידים בתלת-ממד, פיברובלסטים עם השתקת TM one מהונדסת, כפי שמוצג כאן בדמויות D, E ו-F, משרים פלישה מוגברת של תאי אפיתל של השכיריות בהשוואה לפיברובלסטי השליטה בדמויות A, B ו-C. שימו לב לבליטות האפיתליות הפולשות אל המטריקס בספרואידים המכילים פיברובלסטים עם השתקת TM one, כפי שסומן בחצים בדמויות D ו-F. פיברובלסטים עם ביטוי יתר מהונדס של TM one, המוצגים כאן בדמויות J, K ו-L, השריו פלישה מופחתת של שורת תאי סרטן השד sum 1 59 בהשוואה לפיברובלסטי השליטה בדמויות G, H ו-I. השוו את היעדר הבליטות האפיתליות בספרואידים המכילים פיברובלסטים מהונדסי TM one לאלו המכילים פיברובלסטי שליטה, כפי שסומן בחצים בדמויות G ו-I, לאחר שהוקמו ספרואידי תרבית השיתוף.

ניתן לבודד אוכלוסיות תאים מסטרואידים על ידי זריעה מחדש בהקשר דו-ממדי. תמונה מורכבת זו מציגה תרביות תחת מיקרוסקופיה של אור ופלואורסצנציה לאחר בידודן מתרבית matrigel. יום אפס מייצג דימוי מיד לאחר הבידוד; ימים אחד, שני וחמישה מציינים את הימים לאחר הבידוד.

שימו לב כי הילה של תאים העוזבים סטרואיד זה גדלה עם הזמן. בסופו של דבר, נותר "סטרואיד רפאים" עם תאים מעטים מאוד, כפי שמודגש כאן על ידי החץ. סטרואידים מעטים מאוד נותרים לאחר הסרת הרפאים ומעבר (passage).

בהתאם לשיעורי הגדילה היחסיים של התאים שנבדקו. אוכלוסיות טהורות עשויות להיווצר באמצעות מעבר סדרתי (serial passage) או שניתן למיין אותן באמצעות סממני תאים מתאימים. בדוגמה זו, דגימות מנותחות באמצעות ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בפלואורסצנציה ירוקה ובפלואורסצנציה אדומה לזיהוי פיברובלסטים המבטאים GFP ותאי אפיתל המבטאים mCherry, בהתאמה, כדי לקבוע את האוכלוסיות היחסיות של תאי אפיתל ופיברובלסטים.

לאחר בידוד מתרבית משותפת בתלת-ממד, תאי אפיתל שומרים על התכונות שהוענקו להם בעקבות התרבית המשותפת עם פיברובלסטים לאורך פרקי זמן ממושכים, מה שמאפשר הזדמנות רחבה לניתוח. בדוגמה זו, חשיפה לפיברובלסטים חסרי TM one הובילה להגברת הנדידה בתאי H max שגודלו בתרבית משותפת, תופעה שנמשכה שבועות לאחר הבידוד מהתרבית המשותפת בתלת-ממד, בהשוואה לחשיפה לפיברובלסטים של ביקורת, המסומנים כאן כ-C. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח שינויים בביטוי גנים ובסימנים אפיגנטיים, על מנת לענות על שאלות נוספות בנוגע להשפעות הפיברובלסטים על תאי אפיתל.