שיטות Assay תסיסנית התנהגות
7 במרץ 2012
תסיסנית melanogaster היא מערכת גנטית התנהגותית מודל צייתן, שבו נעשה שימוש כדי להבין את הבסיס המולקולרי התאי של תהליכים ביולוגיים רבים חשובים יותר ממאה שנים 1. תסיסנית נוצלה היטב כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס הגנטי של ההתנהגות במהירות הבזק.
המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים שיטות לבחינת התנהגויות תחושתיות, מוטוריות ושל קואורדינציה ב-drosophila. זאת מושג על ידי הערכה ראשונית של התפקוד המוטורי של הזחלים באמצעות מבחן זחילה, הערכה של התפקוד המוטורי של הבוגרים באמצעות מבחן הטבעת, והערכה של יכולות התחושה והקואורדינציה של הבוגרים באמצעות מבחן חיזור. בסופו של דבר, פאנל זה של מבחנים התנהגותיים יכול להראות כיצד גורמים גנטיים וגורמים חיצוניים, כגון טיפולים תרופתיים, יכולים להשפיע על הפעילות והקואורדינציה.
בתוך הסופלה. היתרון העיקרי של בדיקה זו על פני שיטות קיימות כמו negative geo axis, הוא שבבדיקת הטבעת (ring assay) התפוקה גבוהה יותר והיא רגישה יותר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המחלות הנוירודגנרטיביות, כגון זיהוי בשלב מוקדם של פגמים במוטוריקה.
ד"ר ג'יימי בקנל (Jamie Becknell), פוסט-דוקטורנט במעבדתי, תדגים בדיקה זו. בדיקת זחילה של זחלים משמשת למדידת ההשפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים על הניידות. כדי להתחיל, יש להכין הכלאה של 10 עד 15 זכרים ו-10 עד 15 נקבות בתולות בבקבוק סטנדרטי. לאחר 24 שעות, בוגרים בריאים יטילו מספיק ביצים כדי לאכלס את הבקבוק, כך שהאוכלוסייה תהיה בעלת גיל תואם של 24 שעות.
העבירו את הבוגרים לבקבוק נקי וחזרו על התהליך. כעת, דגרו את הבקבוק עד שיופיעו בתוך המצע המזין בבקבוק זחלים בשלב ה-third instar. הוסיפו 50 עד 100 milliliters של סוכרוז 20% והמתינו 20 דקות.
הזחלים יצופו למעלה; אספו את הזחלים באמצעות פיפט סרולוגית של 25 milliliter שקצהה נגזז והניחו אותם בסלסילת רשת. שטפו את הזחלים שבסלסילת הרשת פעמיים במים דאיוניים. כעת ניתן לבצע עליהם את הניסוי.
כדי לטפל בזחלים באמצעות תרופה, השתמשו במברשת כדי להעביר את מספר הזחלים הרצוי לכלי כימי של 5 milliliters המכיל תמיסה של 5% sucrose ואת התרופה הנבדקת. אפשרו להם להזין מהתמיסה הסוכרית עם התרופה במשך 15 דקות, לאחר מכן שפכו אותם חזרה דרך סל הסנן, שטפו אותם, והמשיכו במדידת השפעת התרופה על הניידות. השתמשו במברשת כדי להעביר זחל בודד לצלחת פטרי של 15 centimeter המכילה 2% agarose.
הניחו מעל דף נייר גרף. כעת אספו את הנתונים. פשוט ספרו את מספר קווי הרשת שהלבה חוצה בדקה אחת.
בשלב הבא, השתמש במברשת כדי להעביר את הלרווה לבאר של צלחת ניתוח מזכוכית המכילה תמיסת משחת שמרים מדוללת תחת מיקרוסקופ ניתוח; לאורך פרק זמן של דקה אחת, ספור את התכווצויות ה-Percy. התכווצות בודדת נספרת כתנועה מלאה מהחלק האחורי אל החלק הקדמי. חזור על הפעולה עד לספירת מספר הלרובות הרצוי.
פרוטוקול הטבעת מודד את מהירות התנועה של בעלי חיים בוגרים. אספו זבובים זכרים בוגרים שזה עתה בקעו תחת הרדמה קלה והעבירו אותם לבקבוקון סטנדרטי המכיל מזון רגיל או מזון עם תרופה. הניחו כ-25 זבובים בכל בקבוקון. החזיקו את הזבובים בטמפרטורת החדר למשך יומיים עד שלושה ימים לצורך התאוששות מלאה מההרדמה והגעה לרמות תמידיות של התרופה.
לאחר מכן, העבירו כ-25 זבובים ללא הרדמה למבחנות פוליסטירן עם פקקים מעוצבים, והרכיבו את המבחנות במכשיר טבעת אחד או יותר. אפשרו לזבובים לנוח במשך 15 עד 20 דקות, ובזמן זה כווננו מצלמה דיגיטלית לצילום המבחנות ממבט צדי; הכינו טיימר והגדירו אותו למשך הזמן הרצוי עבור הבדיקה. בדרך כלל נדרשות שלוש שניות לביצוע הבדיקה.
החזיקו את מכשיר הטבעת ביד אחת מבלי להפריע לזבובים, והחזיקו את טיימר המצלמה ביד השנייה בצורה מוכנה. הקישו את המכשיר על ספסון המעבדה שלוש פעמים כדי להפיל את הזבובים, ובמקביל הפעילו את טיימר הספירה לאחור של המצלמה. חזרו על הניסוי פעם לדקה עד לביצוע חמישה או שישה ניסיונות.
קריטי שלא להשתמש שוב בבקבוקוני הבדיקה העשויים פוליסטירן לאחר איסוף סדרות הנתונים הראשוניות. זאת מכיוון שזבובים חדשים שיונחו בבקבוקונים משומשים לא יטפסו באותה מידה כזבובים שיונחו בבקבוקונים טריים. כדי לאסוף את הנתונים באמצעות תוכנה לצפייה בתמונות, יש לדרג את הגובה הממוצע של הטיפוס עבור הקבוצות השונות.
בדיקה זו דורשת הכנת הכלאות גנטיות בבקבוקים המפיקים צאצאים בשפע, על מנת לאסוף זבובים לצורך הבדיקה. בתוך מספר שעות מהשחר הסובייקטיבי של בעלי החיים, רוקנו את הבקבוקים כדי לאסוף את כל הבוגרים במרווחי זמן של שלוש עד ארבע שעות. אספו זכרים ונקבות שזה עתה בקעו וטרם נחשפו מינית; שכן את הזכרים באופן פרטני במבחנות עם מזון, ואת הנקבות בקבוצות של חמש עד שש.
בכלובים דומים, נדרש מספר שווה של זכרים ונקבות לצורך הבדיקה. לאחר בידוד הזבובים שנאספו למשך חמישה ימים, הכינו אותם להעברה לגלגל הזיווג ובצעו את הבדיקה. לאחר מכן, העבירו בזהירות נקבה אחת וזכר אחד לתא של גלגל הזיווג תחת מיקרוסקופ דיסקציה.
הצפו בזוג במשך 10 דקות או עד להשגת זיווג מוצלח במהלך זמן זה. רשמו מתי נצפתה לראשונה כל אחת ממספר התנהגויות. רשמו מתי הזכר פנה לראשונה לעבר הנקבה.
כאשר הזכר נוגע לראשונה בנקבה עם רגלו, רשמו זאת; כאשר הזכר פורש ומרעיד כנף לראשונה, רשמו זאת; כאשר הזכר לוקק לראשונה את איברי המין של הנקבה, רשמו זאת; כאשר הזכר מקמט לראשונה את בטנו מתחת לגופו, רשמו זאת. רשמו כאשר הזכר מנסה לראשונה להזדווג עם הנקבה. לבסוף, רשמו את סך הזמן שהוקדש להתנהגות חיזור עד להתרחשות ההזדווגות.
עבור בעלי חיים מסוג בר, הדבר קורה כמעט תמיד בתוך חמש עד 10 דקות; יש לאסוף נתונים לפי שלושה פרמטרים שונים. ראשית, השהייה (latency) להופעת התנהגות היא הזמן שחולף עד שהיא נצפית לראשונה. שנית, התדירות של התנהגות היא האם היא נצפתה או לא.
ושלישית, מדד החיזור הוא הזמן שהושקע בחיזור חלקי הזמן הכולל עד לזיווג בניסוי עם בעלי חיים. מוטציות ב-F-U-S-T-L-S קשורות לטרשת נרנית שרירית. מוטנטים של הגן עם הכנסה במרכז הראו מחצית מיכולת הזחילה של בישControls מסוג בר (wild type) משמאל, ומוטציית missense מסוג R 5 21 C הפחיתה את מהירות הזחילה לכ-1 cm/min בלבד.
בדיקת טבעת של זבובים בוגרים צעירים מסוג בר (wild type) הניבה גובה ממוצע של טיפוס שבין שלושה לחמישה סנטימטרים בפרק זמן של שלוש שניות. במבחן זה, לא נצפתה דסנסיטיזציה (הפסקת רגישות) גם לאחר עד חמישה ניסיונות רצופים במרווחים של דקה אחת ביניהם במהלך ביצוע מבחן הטבעת. חשוב לזכור להיות מדויקים ככל האפשר בכל הנוגע לתזמון.
ברגע שהשיטה נשלטת, ניתן לבצע את ניסוי הצפיפות של ה larvae תוך 30 עד 40 דקות לצפייה ב-10 ניסיונות עבור גנוטיפ אחד, אם הוא מבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו גם הבנה טובה של האופן שבו יש לצפות ולמדוד התנהגויות חיזור בזבוב.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים שיטות לבחינת התנהגויות תחושתיות, מוטוריות ותיאום מוטורי ב-Drosophila. המחקר עושה שימוש במגוון בדיקות להערכת התפקוד המוטורי והתיאום, ובכך מספק תובנות לגבי הגורמים הגנטיים והחיצוניים המשפיעים על התנהגויות אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה התנהגותית
- גנטיקה
רקע
- Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל נפוץ בשימוש.
- הוא תרם תרומה משמעותית להבנת תהליכים ביולוגיים.
- הבסיס הגנטי של התנהגות הזבוב נחקר באופן נרחב.
- בדיקות התנהגותיות יכולות להניב תובנות לגבי מחלות נוירודגנרטיביות.
מטרת המחקר
- להדגמת שיטות להערכת תפקוד מוטורי של Drosophila.
- להערכת ההשפעה של גורמים גנטיים וחיצוניים על ההתנהגות.
- לספק חלופה רגישה בעלת תפוקה גבוהה יותר לבדיקות קיימות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקת זחילה להערכת התפקוד המוטורי של הזחלים.
- בדיקת טבעת להערכת התפקוד המוטורי של הבוגרים.
- בדיקת חיזור להערכת הקואורדינציה והיכולות החושיות של הבוגרים.
- השוואה בין הבדיקות החדשות לשיטות מסורתיות.
תוצאים עיקריים
- בדיקת הטבעת (ring assay) מציעה תפוקה ורגישות גבוהות יותר.
- בדיקות התנהגותיות יכולות לזהות פגמים מוטוריים בשלבים מוקדמים.
- טיפולים גנטיים ותרופתיים משפיעים על הפעילות והקואורדינציה של Drosophila.
- התובנות שניתן להפיק עשויות לסייע למחקר על מחלות נוירודגנרטיביות.
מסקנות
- בדיקות ב-Drosophila יעילות לחקר התנהגויות מוטוריות ותחושתיות.
- שיטות אלו יכולות להעמיק את ההבנה של השפעות גנטיות על התנהגות.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בממצאים אלו למחקרים על מחלות נוירודגנרטיביות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות התנהגותיות חזקות ב-Drosophila מאפשרות חקירה בשלבים מוקדמים של השפעות גנטיות ופארמקולוגיות על פנוטיפים של מוטוריקה וקואורדינציה, ובכך תומכות בביטחון ניבוי במודלים של מחלות וניוורו-דגנרציה. מדדים כמותיים בעלי תפוקה גבוהה מזחילה של זחלים, טיפוס של בוגרים (RING) ובדיקות חיזור מקלים על בדיקה מהירה של השערות ועל הפחתת סיכונים מכניסטיים בנקודות מפתח קריטיות של תהליך הגילוי. שיטות אלה מהוות בסיס למיון תיקי פיתוח על ידי אספקת נתונים ניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב לצורך תיקוף מטרות וסריקת תרכובות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה פונקציונלית של הפרעות גנטיות והשפעות של תרופות על התנהגות מוטורית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי כימות תוצאות פנוטיפיות במודלים רלוונטיים למחלה.
- מסייע במיון מהיר של מטרות בהתבסס על נקודות סיום התנהגותיות הניתנות לשחזור.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק בדיקות התנהגותיות מתוקתקות בעלות תפוקה גבוהה להערכה ניתנת להרחבה של תרכובות.
- מספק תוצאים כמותיים וסטנדרטיים להשוואה בין תנאים שונים.
- מפחית את השונות בבדיקה ומגביר את השחזור עבור קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פנוטיפים התנהגותיים עם נקודות קצה תרגומיות הרלוונטיות למודלים של מחלות נוירודגנרטיביות.
- מאפשרת רציפות מגילוי גנטי ועד לתיקוף פרה-קליני של תוצאות פונקציונליות.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על מדדי התנהגות מוקדמים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
בדיקות התנהגותיות אלו ממצבות את Drosophila כפלטפורמה רב-גונית, החל משלבי הגילוי המוקדמים, דרך זיהוי מועמדים תרופתיים ועד למחקר פרה-קליני, ובכך הן מאפשרות שילוב חלק של נתונים גנטיים, פרמקולוגיים ופנוטיפיים.
- ביולוגיה של גילוי: בדיקות התנהגותיות כמותיות תומכות בבדיקת השערות ומבהירות קשרי גן-תפקוד.
- סריקה: בדיקות RING ובדיקות זחילה בעלות תפוקה גבוהה מספקות פלטפורמות הדירות וניתנות להרחבה לסריקה של תרכובות וסריקה גנטית.
- אנליטיקה: מדידות סטנדרטיות (למשל, גובה טיפוס, מהירות זחילה, מדד חיזור) מאפשרות השוואה סטטיסטית חסונה בין גנוטיפים וטיפולים שונים.
- מחקר תרגומי: נקודות קצה התנהגותיות תואמות פנוטיפים רלוונטיים למחלה, ובכך תומכות בפיתוח של ביומרקרים תרגומיים.
- שימוש חוזר ארגוני: הבדיקות ניתנות להתאמה לרקעים גנטיים שונים ולסוגי תרופות מגוונים, ובכך תומכות ביישומים רחבים של פורטפוליו המחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פנוטיפיקה התנהגותית לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תרכובים ומטרות רלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של Drosophila ובפנוטיפ התנהגותי.
- דורש גישה לציוד דימוג ולתשתית בדיקה סטנדרטית.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך קבלת תוצאות הדירות.
- יש להתאים את פרוטוקולי הבדיקה לרקעים גנטיים ספציפיים או לטיפולים תרופתיים.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות רגישות למשתנים סביבתיים ומגבלות בתפוקת הבדיקה עבור סריקות רחבות-היקף.
