תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

מטרת ניסוי זה היא להדגים כיצד ניתן להשתמש במערכת של תרבית ראשונית של תאי עצבים כדי לחקור את השכיחויות של השגחה (latency) והפעלה מחדש (reactivation) של נגיף ההרפס סימפלקס (herpes simplex virus). דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד נוירונים מהגנגליונים הצוואריים העליונים (superior cervical ganglia) מעוברים של RA, וטיפוח נוירונים שבודדו מגנגליונים מופרדים לאחר סילוק תאים שאינם נוירונים. זיהום לטנטי של HSV מוקם באמצעות נגיף EGFP להדבקת הנוירונים בנוכחות של מעכב רפליקציה ליטית.

השלב הבא הוא השראת ריאקטיבציה של התרביות המודבקות במצב רדום. לבסוף, יעילות הריאקטיבציה מוערכת באמצעות ניטור של ביטוי EGFP לאורך זמן. באופן סופי, ניתן לקבל תוצאות המראות כיצד מסלולי איתות עצביים שונים מווסתים את הרדמה והריאקטיבציה של נגיף ההרפס סימפלקס באמצעות שימוש במעכבים כימיים, השתקת RNA והחדרת גנים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת מחקרים מפורטים של האינטראקציות המווסתות את הלטנציה של herpes simplex virus בתוך הנוירון המארח ברמה המולקולרית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הלטנציה של herpes simplex virus, כגון מהם האותות הפועלים לדכאי את הגנום הלטנטי וכיצד מופעל תהליך הריי-אקטיבציה ברמה המולקולרית? בנוירונים, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי לטנציה של HSV-1.

ניתן ליישם זאת גם על וירוסים נוירוטרופיים אחרים ממשפחת ה-alpha herpes. את הפרוצדורה ידגימו Marigo Kochi ו-Julian Kim, שניהם סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדותינו. עבור פרוטוקול זה, מבודדים נוירונים מהגנגליונים הצוואריים העליונים (SCG) מגורי חולדה ביום עוברים E 21, שהוצאו מרחמה של נקבת חולדה הרייה. בעבודה תחת מכסה נתיחה, יש להקריב כל גור על ידי כיוון המספריים לבסיס הצוואר, ממש מעל הכתפיים, והפרדת הראש מהטורסו. כדי לחשוף את הגנגליונים, השתמשו במחטים בכיל 23 gauge כדי לקבע את הראש, כאשר הצוואר פונה כלפי מעלה, בשלושה מיקומים.

ראשית, קבעו את חוט השדרה בעזרת סיכה. שנית, משכו את העור הקדמי מעל האף וקבעו אותו בסיכה, ושלישית, קבעו את הוושט והקנה הרחק מאזור גב הצוואר. חפשו את ה-SCG על ידי איתור נקודת הפיצול של העורק התרדמי.

העורק הקרוטידי הוא מבנה זוגי. ישנן שתי התפצלוּת באופן סימטרי משני צידי הצוואר, ולפיכך ישנם שני s CGS לכל pop. ה-SCG ממוקם ממש מתחת לענף.

הפרידו את ה-SCG מהעורקים על ידי מתיחת הפיצול (bifurcation) באמצעות שני הקצוות. ה-SCG הוא שקוף וחסר צבע בהשוואה לרקמה השומנית הצהובה והאטומה המקיפה את הפיצול. העבירו את הגנגליונים ל-12 milliliters של L 15.

מדיה מועשרת בגלוקוז בתוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר על קרח. לאחר שכל ה-SCGs נאספו מהעוברים ונמשכו בעדינות, סובב את הגנגליונים בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-600 RPM, והסר את עודפי המדיה.

השעה את הגנגליונים במיליליטר אחד של מצע L 15 המכיל trypsin ו-collagenase. דגרו למשך 24 דקות ב-37 °C.

יש לערבב בכל שמונה דקות. לאחר מכן, יש להוסיף 10 milliliters של sea media כדי להשבית את ה-trypsin לצורך סרכוז למשך דקה אחת. ב-600 RPM, יש להסיר כמה שיותר מתוכן של tryin collagenase media ולשטוף את הגנגליונים עם 10 milliliters של C media בסרכוז למשך דקה אחת ב-600 RPM.

חזור על שטיפה זו פעם אחת. הסר את מדיום השטיפה וסספנד מחדש את הגנגליונים ב-1 mL של מדיום C כדי לבצע דיסוציאציה על ידי טריטורציה באמצעות מחט בכיל 21 המחוברת למזרק של 5 mL, למשך מקסימום 15 מחזורי דחיפה ושאיבה. השלם את הטריטורציה באמצעות מחט בכיל 23 עד להפרדה של רוב הגושים.

הסר גושים שנותרו של תאים על ידי סינון הנוירונים המופרדים דרך מסנן ניילון של 70 micron לתוך מבחנה קונית של 50 milliliter. השג מדגם של 10 microliter מתלי תאי התאים המסוננים, תערובת של triam blue, כדי לקבוע את מספר התאים החיים. ספור את מספר התאים שדוחים באופן פעיל את הצבע באמצעות hemo cytometer.

בשלב הבא, חלקו 5,000 עד 6,000 תאים חיים בסך הכל ב-100 µL של מצע C לתוך כל באער של פלטת תרבית רקמה בעלת 96 באערים, מצופה מראש בקולגן ובלמינין, הכוללת 50 ng/mL של nerve growth factor במצע C. דגרו למשך לילה ב-37 °C, וביום למחרת, יום 1 in vitro או DIV 1, בדקו היצמדות תקינה של הנוירונים וצמיחה של כמה בלטות אקסוניות.

החליפו את מצע C בבארים ב-50 µL של מצע neuro basal או NBM המכיל NGF Acho ו-five fluoro two doxy uridine. החליפו את המצע שורה אחר שורה כדי להבטיח שהתאים לא יתייבשו. דגרו את התרביות ב-37 °C למשך חמישה ימים.

יש לנטר את התרבית מדי יום כדי לוודא את מותם של התאים שאינם נוירונים ואת צמיחתם של הנוירונים. כדי להתחיל חלק זה של הפרוטוקול ביום הששי למשב עם (day in vitro six), ודאו שמרבית תאי התמיכה שאינם נוירונים חוסלו. חשוב ביותר למזער מניפולציות פיזיות מיותרות של הנוירונים בכל עת.

יש להסיר ולהחליף את המצע בעדינות רבה ובאיטיות, אחרת עלויות הלחץ המכני שייווצרו עלולות להשפיע על חיוניות הנוירונים. יש להוסיף aciclovir או בקרת רכב (CV) למצע הקיים בכל באר עד לריכוז סופי של 100 micromolar. יש להוסיף את ה-CV באיטיות ובעדינות כדי להבטיח שהכוח המכני לא ישפיע לרעה על התאים ביום למחרת.

ביום השביעי לאחר הזריעה (DIV 7), הדביקו את תרביות ה-SCG באמצעות HSV-1 רקומביננטי המבטא רפורטר EGF המחובר לחלבון הלייטי הויראלי US 11 בריבוי הדבקה (MOI) שבין 1 ל-2. הוסיפו את הוירוס המדולל ישירות למצע הגידול הקיים בבאר. כללו ביקורת של הדבקה דמה (mock infection) והדבקה לייטית.

ביקורת חיובית במצע נטול CV. יש להמתין להמשך ההדבקה במשך שעתיים עד שלוש בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לאחר מכן, החליפו את מצע ההדבקה ב-NBM טרי המכיל NGF ו-CV. חשוב מאוד לפעול בעדינות רבה בעת החלפת מצע ההדבקה. הטו את הצלחת לעברכם והסירו לאט את המצע מתחתית הבאר.

לאחר מכן, כוון את קצה הפ pipette אל דופן הבאר ולא אל תחתיתה, ואפשר למצע להחליק בעדינות על התאים. החלף את המצע בשורה אחת בכל פעם כדי למנוע את התייבשות התאים. החזר את התרביות לאינקובטור, תוך טיפול עדין ככל האפשר כדי למנוע פגיעה ביכולתן לתמוך ב-HSV one latency.

יש לתחזק את התרביות במשך שישה ימים בטמפרטורה של 37 °C, שבמהלכם הווירוס יבסס לטנציה (חמדה). במהלך תקופה זו, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לנטר את ביטוי ה-us 11 EGFP כאינדיקטור לרפליקציה ליטית.

כמצופה, לא אמור להיות ביטוי של GFP בביקורת הזיהום המדומה (mock). S 11 EGFP אמור להיות מזוהה רק בזיהום. בארות ביקורת חיובית ללא טיפול ב-CV מעידות על זיהום ראשוני מוצלח ושכפול ליטי פרודוקטיבי.

כדי להעריך את הפעלה מחדש (reactivation) ב-DIV 14, החליפו בזהירות את ה-CV המכיל מצע במצע טרי ללא CV, כפי שבוצע קודם לכן. כוונו את קצה הפפיטה לדופן הבאר ולא לתחתיתה, ואפשרו למצע להחליק בעדינות על התאים במידת הצורך. הוסיפו משתנים פרמקולוגיים או ביולוגיים כגון LY 2 9 0 0 4 בריכוז 20 micromolar.

אין לצפות לביטוי GFP בתרביות המודבקות בצורה חבויה שטופלו ב-A CV. החזיר את התאים ל-37 degrees Celsius למשך תקופה של חמישה עד שישה ימים. עקוב אחר התרביות החיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות נוירונים העוברים ריאקטיבציה.

תדירות ההפעלה מחדש מחושבת על ידי ספירת מספר הבארות המכילות נוירונים חיוביים ל-EGFP והבעת נתון זה כפרופורציה ממספר בארות הדגימה הכולל. איור זה ממחיש דוגמה שבה trigger statin, המהווה משרה ידוע של הפעלה מחדש, מיושם על תרביות SCG מזוהמות בשלב מאוחר. ההפעלה מחדש נוטרה והוערכה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מדי יום לאחר הטיפול התרופתי, למשך תקופה של חמישה ימים.

עם TSA, ההפעלה מחדש מגיעה ל-50% מהמקסימום בתוך יומיים, ובתוך חמישה ימים, ההפעלה מחדש מגיעה ל-60%. קו הבסיס או ההפעלה מחדש הספונטנית מיוצגים על ידי ה-DMSO. בתרביות ביקורת מטופלות בניסוי זה היא כ-10%, ובדרך כלל נעה בין 5% ל-20% בשימוש במערכת in vitro זו. תרביות SCG מזוהמות בשלב מאוחר טופלו גם ב-LY 2 9 0 0 4.

הושוו תרביות של השראה מוכרת להפעלה מחדש, כאשר ההפעלה הושרית על ידי LY, לאלו שטופלו במעכב סינתזה של DNA ויראלי, phospho, ללא חומצה אצטית, ובשני התרכובות יחד כפי שמוצג כאן; ביטוי של US 11 EGFP נפגע על ידי PAA בתרביות שהושרו להפעלה מחדש עם LY 2 9 4 0 0 2, מה שמעיד על כך שביטוי US 11 EGFP תלוי בשכפול DNA ויראלי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להקפיד על טכניקה סטרילית ולטפל בתרבית ה-CG בעדינות רבה ככל האפשר כדי למנוע הגברה של הפעלה מחדש ספונטנית המושרית על ידי סטרס או תנועות מכניות. לאחר ביצוע פרוצדורה זו להקמת זיהומי HSV one חבויים בנוירונים בתרבית, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון S-H-R-N-A, knockdown וביטוי אקטופי של גן פראי ושל גן מוטנטי עם אובדן תפקוד, וזאת כדי לאפיין פונקציות נוירונליות המווסתות את החבויות וההפעלה מחדש של HSV one.

זכרו כי HSV-1 הוא פתוגן אנושי הדורש אמצעי בטיחות ברמה של PSL 2. עליכם להיות מיומנים בעבודה בתנאי PSL 2 לפני ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבין כיצד להקים תרביות SCG לצורך יצירת זיהומי HSV-1 לטנטיים, וכיצד להשרות ביעילות ריאקטיבציה בנוירונים.