Culturing ויישומים של סיבוב bioreactor וול כלי נגזר מודלים 3D תא אפיתל

פרוטוקול לא-שגרתי זה מציג מערכת פשוטה וחסונה לתרבית תאי אפיתל אנושיים למודלים תלת-ממדיים (3D) אורגנוטיפיים המשחזרים את הרקמה האנושית in vivo. ראשית, תאי אפיתל גודלים כשכבה Ein-layered (monolayer) שאיפה בבקבוק תרבית רקמה ונאספים, ולאחר מכן משולבים עם חרוזי נשא מיקרוסקופיים (micro carrier beads) בביוראקטור STLV. סיבוב ה-STLV על הפלטפורמה יוצר סביבת נפילה חופשית קבועה בעלת גזירה נוזלית נמוכה, המאפשרת לתאים להיצמד ולגדול על החרוזים וליצור אגרגטים תאיים לאחר 96 שעות ובערך בכל יום לאחר מכן.

חדש את המצע ב-SDLV כדי להבטיח תמיכה בחילוף החומרים התאי. לאחר היווצרות אגרגטים, דגום את המדגמים לצילום במיקרוסקופ אור פעם בשבוע כדי לעקוב אחר התקדמות הפיתוח, וזאת לאחר שהושלמה היווצרות האגרגטים והבידול התאי. זרע את האגרגטים לצורך ניתוחים ובדיקות ניסיוניות בהמשך. באופן סופי, מערכת זו יכולה להפיק מערכות מודל אורגנוטיפיות הדומות לתנאי in vivo עבור מגוון רחב של מחקרים מדעיים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבית תאים קונבנציונלית, הוא שתאי אפיתל יעברו דיפרנציאציה וקיטוב לצברים דמויי רקמה, ולכן יתנהגו מבחינה מורפולוגית ותפקודית באופן דומה לרקמה אנושית אותנטית. מערכת מודל תלת-ממדית זו מספקת תובנות נוספות לגבי ביולוגיה של תאי אפיתל, אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן, והיחסיים המורכבים בין סוגי תאים שניתן להחדיר למערכת. ד"ר אנדראה רדקי.

פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי ידגים כעת את הפרוצדורה לניקוי רעלים בביוראקטור של כלי דמי דופן עם סיבוב איטי. כסו את הפתחים הפתוחים בעזרת פקקי lure. מלאו את ה-STLV ב-95% ethanol והמתינו 24 שעות להגעה לשיווי משקל.

הסיר את האתנול, לאחר מכן מלא במים מזוקקים סטריליים והדגר למשך 24 שעות. באמצעות הכלים המסופקים על ידי הספק, שחרר את כל הברגים והסר את הפקק המרכזי מה-STLV. הנח אותם בשקיית סטריליזציה ובצע אוטוקלאב בטמפרטורה של 110 °C למשך 20 דקות. הרכב מחדש את ה-STLV וחזור על תהליך חיטוי הרעלים כדי להבטיח סטריליות.

כעת, הדקו את הברגים של ה-STLV. חברו ברזים חד-כיווניים שעברו עיקור מראש לכל פתח. כעת הסירו את הבוכנות ממזרקים מסוג lure lock בנפח 10 מיליליטר וחמישה מיליליטר, והניחו את הבוכנות בתוך העטיפות.

כדי לשמור על סטריליות, הברגו את המזרקים אל ברז העצירה. המשיכו להוסיף DPBS למזרק ה-10 milliliter עד שה-STLV יהיה מלא והמזרק של ה-five milliliter יתחיל להתמלא. לאחר מכן, החזירו את הבוכנות הסטריליות לכל מזרק והסירו בועות שנותרו בביוראקטור על ידי דחיפה לסירוגין של בוכנות המזרקים.

סגרו את הברזים וחברו את ה-STLV לפלטפורמה המסתובבת האנכית. סובבו למשך 24 שעות לפחות כדי לבדוק דליפות במבחנה קונית של 50 milliliter. הוסיפו 15 milliliters של DPBS ל-250 milligrams של חרוזי cyto dex microcar והעבירו לאוטוקלב לאחר קירור.

הסרו את ה-DPBS ושטפו שלוש פעמים עם מצע תרבית לתאי אפיתל. סובבו את המבחנה כדי להמיס מחדש את החרוזיים. לאחר מכן, המיסו מחדש את החרוזיים ב-15 milliliters של מצע תרבית.

ראשית, תרבתו 1x10⁷ תאים אפיתליאליים כשכבה אחת (monolayers) בבקבוקי תרבית רקמה. קצרו את התאים, ספרו אותם וקבעו את חיוניות התאים באמצעות צביעה בשלילה ב-trypan blue. לאחר מכן, הוסיפו את התאים לחרוזי הניגוב שהוכנו.

שטפו את הפפית הקונית כדי להבטיח שכל התאים הועברו. לאחר מכן, הוציאו את ה-DPBS ואת המזרקים מה-STLV. כמו כן, הסירו את הפקק מהפתח המרכזי באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר.

העבירו את תרחיף חרוזי התאים האפיתליאליים אל ה-STLV. שטפו את הפיה הקונית פעם אחת כדי להעביר את כל התאים והחרוזים. לאחר מכן, החזירו את הפקק של פתח המרכז.

בשלב הבא, הוצאו את הבוכנות ממזרק של 5 מיליליטר וממזרק של 10 מיליליטר והניחו את הבוכנות בתוך העטיפות. כדי לשמור על סטריליות, סגרו את פתחי המזרקים באמצעות ברזי עצירה פתוחים. מלאו את ה-STLV במצע גידול.

החליפו את הבוכנות וסגרו את ברז המעצור. כעת השרו את תרבית ה-STLV שזרעה זה עתה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות ללא סיבוב. לאחר הוצאת ה-STLV מהאינקובטור, פתחו את ברז המעצור.

הסיר בועות אוויר באמצעות הבוכנות וסגור את הברז. לאחר מכן, הגדר את ה-STLV לסיבוב רציף במהירות של 20 RPM בתוך האינקובטור. לאחר 96 עד 120 שעות, החלף את המצע על ידי הוצאת המזרקים ופתיחת שני הברזים ב-STLV כדי לאפשר לחרוזי הג'ל ולתאים לשקוע.

לאחר ההתייצבות, שפו בעזרת המזרקים כ-75% מהמדיום דרך פתח הצד כדי לבצע את פרוטוקול ההזנה. שוב, המשיכו להשלים את המדיום לפי הצורך על בסיס המטבוליזם התאי. כמו כן, עקבו אחר הצמיחה והחיוניות של האגרגטים מדי חמישה עד שבעה ימים.

כדי למנוע גזירת צברים, השתמשו בטיפ של פיפט 1000 µL שנקטע כשני סנטימטרים מהקצה ועומסר. הסירו בזהירות 200 µL של צברים מהפתח המרכזי וחלקו לשתי מבחנות של 1.5 mL. השתמשו במנה אחת לניטור חיוניות התאים. לאחר הפרדת התאים מהחרוזיים לפי גודלם, העריכו את החיוניות באמצעות בדיקת הדחייה של trypan blue.

צביעה לצילום של אגרגטים תאיים. הוסף 0.5 עד 1 מיליליטר ממידיום למנת האגרגטים השנייה בנפח 1.5 מיליליטר, והעבר לצלוחית פטרי קטנה באמצעות קצה של פ pipette בנפח 1000 microliter שנקטם. צלם את האגרגטים.

בשימוש במיקרוסקופ אור הפוך עבור חלק מדגמי תאי אפיתל, יש להעביר את הצבירים לבקע חד-פעמי כדי להגביר את אוורור התרבית כשבוע לפני קצירת הצבירים. לצורך ניתוח, הסירו את המזרקים מה-STLV ורוקנו כ-50% מהמדיום דרך הפתח הצדי. הסירו את הפקק המרכזי ושפכו בזהירות את כל התוכן לתוך מבחנה קונית של 50 milliliters דרך הפתח המרכזי.

שטפו את ה-STLV פעמיים עם חמישה מיליליטר מדיה ואחדו את השטיפות עם האגרגטים שנאספו. לאחר מכן, העבירו את האגרגטים מהמבחנה הקונית של 50 מיליליטר ל-Harv. לאחר שבוע, אספו בזהירות אגרגטים עבור פורמטים אפשריים של בדיקות, בדיקות ואנליזה; אגרגטים של תאי אפיתל אנושיים מובחנים גודלו במערכת הביוראקטור STLV.

תמונות ה-SEM וה-TEM נאספו מתאי נרתיק אנושיים שגודלו ב-STLV למשך 39 ימים. שימו לב כי האגרגטים התלת-ממדיים מציגים מאפיינים אולטרה-מבניים הדומים לרקמות: רכסים מיקרוסקופיים, פנימות, שלפוחיות הפרשה תוך-תאיות ומבני מיקרוויליי על הפנין האפיקלי. תמונות מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה קונפוקלית של תאי נרתיק בתלת-ממד מעידות על ביטוי של מוצין וסימנים ספציפיים לתאי אפיתל ולדיפרנציאציה סופית. פנוטיפים רלוונטיים פיזיולוגית משמשים גם כפלטפורמה מצוינת להערכת רעילות של תרכובות.

בדיקת MTT, בדיקה נפוצה למדידת חיות תאים, מטבוליזם או שגשוג תאים, יכולה לשמש למדידת רעילות של כימיקלים ותרכובות שונות. לחלופין, ניתן למדוד רעילות לאחר טיפול בתרכובות בדיקה באמצעות שיטת הדחת trypan blue. בדוגמה זו, בעקבות טיפול ב-NONOXINOL nine, הצבירים הוגינליים הראו תגובת רעילות דומה לזו של מודלי explan צוואריים, אך פרופיל שונה בהשוואה לשכבות מונו'.

האגרגטים התלת-ממדיים מגיבים באופן פונקציונלי, למשל, למערך של גירוי באמצעות מולקולות שמקורן במיקרובים המזוהים על ידי הקולטנים דמויי הטול (toll-like receptors). האגרגטים מגיבים ומפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל חלבון IL six וביטוי של תמלול קולטן הפרוגסטרון. ניתן להבחין בתאי הנרתיק בקולטן המגיב לגירוי הורמונלי.

לאגרגטים התלת-ממדיים ישנה לא רק את היכולת להגיב למולקולות של פתוגנים והורמונים, אלא הם מסוגלים גם לתמוך באופן תפקודי בזיהום של נגיף ההרפס סימפלקס מסוג 2. תמונת מיקרוסקופיה קונפוקלית של אגרגטים נרתיקיים תלת-ממדיים המודבקים ב-HSV 2 מדגימה את הזיהום. ניתן לכמת את התכונות הפיזיקליות והתפקודיות של תאים בודדים בתוך האגרגטים גם באמצעות ציטומטריה של זרימה, לדוגמה, בדיקת ציטומטריה של זרימה למדידת הביטוי של muc1 על פני השטח של תאים נרתיקיים בודדים.

מקבצי הנרתיק התלת-ממדיים ביטאו אחוז נמוך יותר של muck one על פני השטח שלהם בהשוואה לשכבות בודדות לאחר התפתחותן. טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחומי ביולוגיית הרקמות ומחלות זיהומיות לחקור מבנה ותגובות פיזיולוגיות לגירויים. באמצעות מודלים אורגנוטיפיים אלו, אנו מדמים טוב יותר את הביולוגיה האנושית.