השימוש בCystometry במכרסמים קטנים: חקר Chemosensation שלפוחית השתן
21 באוגוסט 2012
Cystometry היא טכניקה יעילה למדידת תפקוד שלפוחית שתן של בעלי חיים קטנים In vivo. השלפוחית הוא החדיר ברציפות בשיעורים נשלטו באמצעות צנתר intravesical, ואילו השופכה תישאר חופשיה להשתנה. זה מאפשר לחוזר, מלא ורוק של שלפוחית השתן, בעוד שלחץ intravesical ונפח בטל נרשמים.
מטרת הליך זה היא לקבוע את השפעתם של תרכובות כימיות על תפקודי האחסון והריקון של שלפוחית השתן. דבר זה משיגים תחילה על ידי השתלת קטטר בשלפוחית השתן. לאחר תקופת התאוששות קצרה, מזריקים תמיסת ביקורת דרך הקטטר למשך 30 דקות.
בעוד שהלחץ התוך-שלפוחיתי ונפח השתן הנפלט נרשמים במשך 30 דקות נוספות, מוזרק לבעל החיים התרכוב הנחקר. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות כיצד כימיקלים מגירות משפיעים גם על דפוס השתן באמצעות ניתוח תדירות השתן. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון רישום הכיווץ של שלפוחית השתן המבודדת, הוא שניתן ללמוד על תפקוד איבר זה בתנאים פיזיולוגיים יותר.
לדוגמה, הפעולות הרגולטוריות של מערכת העצבים המרכזית נשמרות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי הניתוח קשה ללמוד בשל מספר פרטים טכניים ותמרונים שיש להקפיד עליהם כדי להבטיח את הצלחת הניסוי. כדי להכין את הפיתול המיועד להשתלה בשלפוחית השתן, חתוך תחילה פיתול PE 50 לאורך הרצוי והשחל חתיכה לבנה קטנה של קטטר 18 gauge מעל הקטטר הראשי.
לאחר מכן, צרו חבק קטן בקצה על ידי שריפה של קצה אחד של הפרוטור, ושטפו אותו במי מלח כדי להוציא בועות אוויר. כעת, השריעו הרדמה בחולדה נקבה בת 10 עד 12 שבועות באמצעות isof fluorine. לאחר השראת ההרדמה, קבעו את רמת התחזוקה של ה-isof fluorine.
הנח את בעל החיים על גבו והצב מסכת הרדמה קטנה העשויה ממזרק של 10 cc. לאחר גילוח הבטן וחיטוי הדרמיס, התחל בניתוח. הניתוח הבא מבוצע באופן זהה הן בחולדות והן בעכברים.
התחילו בביצוע לפרוטומיה בקו האמצע התחתון כדי לחשוף את שלפוחית השתן. לאחר מכן מתחיל החלק הקריטי ביותר של הניתוח. תחת מיקרוסקופ כירורגי, בצעו תפר מסביב (purse string suture) בצמרת השלפוחית באמצעות חוט תפר מונופילמנטי שאינו נספג במידה 6/0.
בשלב הבא, בעזרת מחט, בצעו ציסטוסטומיה קטנה בתוך תפר ה-purse string. הכניסו את קטטר ה-PE 50 בעל השפה (cuff) דרך חור זה. צינורות קטטר דקים יותר, כגון PE 10, עשויים להפגין התנגדות גבוהה ומשתנה יותר, ולכן הם אינם מומלצים.
הדק את קשרי השרשראות (purse string) מסביב לצינור באמצעות קשר כירורגי. לאחר מכן, משוך בעדינות את הקטטר החוצה עד שקצה השרוול נמצא ישירות מתחת לתפר. חלק מקטטר במידה 18 נדחף לעבר התפר כדי למנוע דליפה.
בדקו אם קיימות דליפות בין הקטטר לשלפוחית השתן, באמצעות עירוי עדין של תמיסת סליין. הדקו כל דליפה באמצעות תפרים נוספים.
כעת, סגרו את שרירי הבטן באמצעות תפרים מונופילמנטיים, והשאירו מעבר לקטטר בחלקו העליון של החתך. העבירו את הקטטר אל האזור הבין-שכמוי (interscapular region) באמצעות מוט מתכת חלול, ובכך מנעו מהחיים לנשוך את הצינור. לאחר הניתוח, יש להניח את מוט המתכת מתחת לעור ומעל לשרירי הבטן והגב.
הדחף את המוט דרך העור של בעל החיים באופן תת-עורי עד לאזור שבין השכמות. השלם את הניתוח על ידי סגירת שרירי הבטן והעור באמצעות תפרים חד-סיביים שאינם נספגים. כעת חשוב מאוד לבדוק את השמיות והיציבות של הקטטר שהושתל על ידי שטיפתו במי מלח.
יש להוציא את תמיסת העירוי מהשלפוחית דרך השופכה. לאחר מתן משכך כאבים תת-עורי, סגרו את הקצה החיצוני של הקטטר באמצעות סרט פלסטיק והצמידו את הקטטר לעור הגב התחתון של החולדה. לסיום, המתינו 30 דקות להתאוששות החיה.
לפני תחילת הציטומטריה, ודאו שהמכשירים כוילו כראוי. מקמו את החולדה בכלוב מטבולי מעל מיכל המכיל שמן המונח על מאזניים דיגיטליים. השלב הבא הוא חיבור הקטטר המושתל לברז תלת-כיווני באמצעות מחבר lure stub.
יש לחבר את הברז למתמר לחץ ולמשאב עירוי. מתמר הלחץ מחובר בהמשך באמצעות מגבר למערכת רכישת נתונים, ומחשב המשתמש בתוכנה זמינה לציבור מתחיל את מדידות הבקרה על ידי הפעלת משאב העירוי להזרקת סליין לשלפוחית השתן. במהלך פרק זמן של 30 דקות, כלוב המטבוליזם תלוי מעל מאזניים דיגיטליים, המשמשים להערכת נפח השתן שהוציא החולדה.
הלחץ התוך-שלפוחי נרשם בעוד השלפוחית מתמלאת ומתרוקנת. בשלב הבא, ניתן להניח תרופות באופן סיסטמי או תוך-שלפוחי במהלך 30 דקות נוספות של איסוף נתונים. עם השלמת הניסוי, יש להקריב את בעל החיים.
עקומת לחץ טיפוסית מחולול של חולדה מראה כי במהלך עירוי נוזלים, קיימת עלייה איטית בלחץ בשלפוחית השתן עד להגעה לסף מסוים. לאחר מכן, השלפוחית תתכווץ והסוגר השפחתי ייפתח, מה שיאפשר למסלול התמיסה שהוחדרה לעבור דרך השופכה. כך מתרוקנת השלפוחית.
ההתכווצות תיפסק והלחץ יירד שוב לרמה הבסיסית. נתונים שנאספו מעכבר מציגים את כל אותם מאפיינים. נעשה שימוש בציטומטריה כדי לזהות את המטרות המולקולריות של שמן חרדל או mo MO הוא תרכובת בעלת ריאקטיביות גבוהה המשמשת מזה זמן רב במודלים ניסיוניים של דלקת והיפראלגזיה של איברים פנימיים כגון שלפוחית השתן.
כצפוי, עירוי תוך-שלפוחיתי של 10 millimolar MO גרם לירידה חלקה במרווח ההתכווצות בעכברים מסוג בר (wild type). באופן מסקרן, עכברים עם חסר ברצפטור MO מסוג TRPA1 הראו תוצאה דומה לזו של עכברים מסוג בר תחת אותם תנאים. לעומת זאת, MO גרם לשינוי חלש בהרבה בפרמטרים הסיסטמטריים בעכבר עם נוק-אאוט של TRPV1 מאשר בעכבר מסוג בר; עכברים עם נוק-אאוט כפול הן של TRPA1 והן של TRPV1 כמעט ולא הגיבו למינון ה-MO.
הנתונים מצביעים על כך ש-TRP V1 עשוי למלא תפקיד מרכזי בגירוי ויסרלי המושרה על ידי MO. תדירות הריקון הממוצעת באופן רגעי לפני ובמהלך עירוי תוך-שלפוחיתי של MO תומכת בנתונים אלה. התדירות הממוצעת היא ביחס לעירוי של תמיסת סלין.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לוודא שהקטטר נשאר מחובר בחוזקה לשלפוחית השתן כדי למנוע דליפה של התמיסה המזרקת אל תוך הבטן. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן מדידת הלחץ התוך-שלפוחיתי (intravesical pressure), הכוללת השתלה של קטטר בשלפוחית השתן והנחת בעלי חיים ערים או מורדמים על במת ציטומטריה תחת perfusion מבוקרת של השלפוחית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
ציסטומטריה היא טכניקה המשמשת להערכת תפקוד שלפוחית השתן בבעלי חיים קטנים in vivo, באמצעות מדידת הלחץ התוך-שלפוחיתי ונפח השתן המופרש. שיטה זו מאפשרת לחקור את מילוי וריקון שלפוחית השתן תחת תנאים פיזיולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אורולוגיה
- פיזיולוגיה
רקע
- ציסטומטריה כוללת עירוי רציף של תמיסה אל תוך שלפוחית השתן.
- השופכה נשארת פתוחה כדי לאפשר מתן שתן במהלך הפרוצדורה.
- טכניקה זו מספקת תובנות לגבי תפקוד שלפוחית השתן בהשוואה למחקרים של איברים מבודדים.
- היא מאפשרת להעריך את השפעותיהם של תרכובות כימיות על תפקוד השלפוחית.
מטרת המחקר
- לקביעת ההשפעה של תרכובות כימיות על תפקודי האחסון והריקון של שלפוחית השתן.
- לניתוח האופן שבו כימיקלים מגרים משפיעים על דפוסי הריקון.
- לספק הבנה פיזיולוגית מעמיקה יותר של תפקוד שלפוחית השתן.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- השתלת קטטר בשלפוחית השתן.
- הזרקה של תמיסת ביקורת למשך 30 דקות.
- רישום של הלחץ התוך-שלפוחיתי ונפח השתן שפונה.
- הזרקה של התרכובת הנחקרת לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- התוצאות מעידות על שינויים בתדירות ההטבלה כתוצאה מחומרים כימיים מגרה.
- הטכניקה מאפשרת מדידות חוזרות של תפקוד השלפוחית.
- הנתונים יכולים לחשוף תגובות פיזיולוגיות לתרכובות שונות.
- הממצאים תורמים להבנת בריאות השלפוחית ומחלותיה.
מסקנות
- ציסטומטריה היא כלי בעל ערך לחקר תפקוד השלפוחית in vivo.
- השיטה משפרת את ההבנה של תגובות השלפוחית לחומרים כימיים.
- היא מציעה יתרונות על פני מחקרי התכווצות של שלפוחית מבודדת באופן מסורתי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ציסטומטריה במכרסמים קטנים מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של מסלולי כימי-תחושה בשלפוחית השתן באמצעות כימות הלחץ התוך-שלפוחיתי ונפח ההשתנה תחת פרופוזיה מבוקרת. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות במודלים פרה-קליניים על ידי קישור גירויים כימיים לתוצרי השתנה תפקודיים, ובכך משפרת את הביטחון החזוי עבור אינדיקציות של שלפוחית נוירוגנית ושלפוחית שתן פעילה מדי. הטכניקה מגשרת בין ביולוגיה של גילוי לרלוונטיות תרגומית על ידי שימור הבקרה האוטונומית, שאינה קיימת בבדיקות של רקמה מבודדת.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות בנוגע לתפקידי הקולטנים TRPV1 ו-TRPA1 במסלולים כימיים ומכניים של תחושה בשלפוחית השתן.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות שינויים תלויי-מינון בתדירות ההשתנה ובמרווחי ההתכווצות.
- ערך חיזוי: תומך בסינון תיקי פיתוח על ידי זיהוי מניעים מולקולריים של גירוי ויסרלי ופנוטיפים של פעילות-יתר של שלפוחית השתן.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקת תרכובות באמצעות קביעת יחסי לחץ-נפח בסיסיים.
- תוצרים כמותיים: אספקת מדידות הדירות של נפח ההשתנה וספי לחץ תוך-שלפוחיתי לאישור פגיעות (hit confirmation).
- יכולת הרחבה של הסריקה: תמיכה בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני ספריות של תרכובות כימיות-חושיות באמצעות שלבי ציסטומטריה סטנדרטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ממדל את הפתופיזיולוגיה של שלפוחית השתן במסגרות פרה-קליניות, למרות ערך תרגומי ישיר מוגבל עקב הבדלים בין מינים בבקרת ההשתנה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהירה את תרומת המסלולים של שחקנים מולקולריים חדשים כגון TRPV1 ברגישות יתר ויסצרלית המושרית על ידי שמן חרדל.
- קידום מותאם סיכונים: מספק מידע לקבלת החלטות של go/no-go על ידי קישור מעורבות המטרה לתוצאות תפקודיות של שלפוחית השתן in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
ציסטומטריה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על מטרות, דרך זיהוי מועמדים (leads) ועד לתיקוף פרה-קליני, באמצעות אספקת מדדים פיזיולוגיים של תפקודי האחסון והריקון של שלפוחית השתן.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי מנגנונים כימוסנסוריים באמצעות עירוי כימי מבוקר ומעקב אחר נפח ולחץ.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות כימות סטנדרטי וניתן לשחזור של דפוסי התרוקנות תחת חשיפה לתרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת ניתוח השוואתי של תדירות ההתרוקנות ומרווחי התכווצות כנקודות קצה כמותיות להשפעות של תרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול של פרמקולוגיה של שלפוחית השתן במערכות רלוונטיות למחלה, למרות מגבלות של מינים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת ניתנת לשימוש חוזר להערכת תרכובות הפועלות על שלפוחית השתן במספר תוכניות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתחושה הכימית של שלפוחית השתן על ידי קישור פעילות קולטן לפלטי פליגה תפקודיים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות התמרת לחץ ומדידת נפח מכויילות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים תפקודיים in vivo המפחיתים סיכונים בבחירת מטרות להתוויות של שלפוחית השתן.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של תרכובות בהתבסס על השפעות על דינמיקת הפליגה ורגישות שלפוחית השתן.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים במכרסמים, השתלת קטטרים וטיפול לאחר ניתוח כדי להבטיח את יציבות הקטטר ולמנוע דליפות.
- תלוי בממירים של לחץ (pressure transducers), משאבות עירוי, מערכות לרכישת נתונים וכלובים מטבוליים לצורך כימות נפח השתן המופרש.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של קצבי פרפוזיה, מינוני תרכובות והגדרות של סף לחץ בין אתרים שונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת תרגום פרוטוקולים בין עכברים לחולדות בשל הבדלים אנטומיים ופיזיולוגיים.
- מוגבל בשל אופיו הפולשני של הניתוח ודרישות ההחלמה שלאחר הניתוח, המגבילים את התפוקה ואת העמידה בכללי רווחת בעלי החיים.
