אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להסביר כיצד לגזור תאי endothelial colony forming cells או e CFCs מדם חבל טבורי אנושי. הדבר מבוצע תחילה על ידי זריעה של תאים חד גרעיים מדם חבל הטבור, ולאחר מכן על ידי שיבוט והרחבה של צמיחות מושבות של E CFCs. השלב השני הוא לאפיין את התאים in vitro באמצעות טכניקת בדיקה חדשנית לתא בודד לבחינת פוטנציאל פרוליפראטיבי קלונאלי.

לבסוף, התאים מאופיינים בבדיקה להיווצרות כלי דם in vivo, באמצעות ייצור והשתלה של ג'לים המכילים E CFCs בעכברי nod skid. בסופו של דבר, ניתן להעריך את ההיווצרות in vivo של כלי דם חדשים (de novo) מלאים בדם של המארח באמצעות צביעת h and e של השתלים התאיים המכילים ECFC. היתרון המרכזי של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות הוא שהן מאפשרות לבחון את הפוטנציאל הפרוליפראטיבי של תאי אנדותל ברמת התא הבודד.

ניתן להרחיב את ההשלכות של טכניקה זו למציאת כלים אבחנתיים וטיפוליים למחלות כגון מחלת העורקים הפריפריאלית או PAD, מכיוון שטכניקה זו מאפשרת לנו לבחון את הפוטנציאל הפרוליפרטיבי והקיבולת הגנית של התאים האנדותליאליים של המטופל. לפני תחילת הפרוצדורה, הוסיפו מיליליטר אחד של קולגן מזנב חולדה, סוג one, לכל באר בצלחת תרבית רקמות בעלת שש בארות, ולאחר מכן דגרו את הצלחת למשך לילה. ביום הפרוצדורה, חלקו את דם השערה למנות של 15 מיליליטר לתוך מבחנות צנטריפוגה קוניות של 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיליליטר של PBS לכל מבחנה ושאבו את התערובת מעלה ומטה באמצעות פיפטה מספר פעמים.

בשלב הבא, שאבו 15 מיליליטר של fial PA למטרתה, הניחו את קצה הפ pipette בתחתית המבחנה של הדם המדולל והוסיפו בזהירות את ה-alpac; סבבבבבו את המבחנות במשך 30 דקות ב-740 ×g בטמפרטורת החדר, ללא הגדרת בלם ההאטה. לאחר הפרדת התאים, השתמשו בפיפטת העברה כדי להוציא את השכבה העכורה של תאי מונונוקלאריים בעלי צפיפות נמוכה הממוקמת בממשק שבין ה-fial peak לבין הפלזמה המדוללת. העבירו את התאים שנאספו למבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של מצע E GM two, וצנטריפוגו את התאים המונונוקלאריים למשך 10 דקות ב-515 ×g בטמפרטורת החדר עם הגדרת בלם האטה גבוהה; שאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והשליכו אותו.

לאחר שטיפת התאים השקועים עם EGM two פעמיים, השעה אותם, את התאים חד-גרעיניים, ב-EGM two בריכוז של 1.25 times 10 to the seventh תאים למיליליטר. כעת, העבר בפיפט ארבעה מיליליטרים של תרחף התאים החד-גרעיניים לכל באר בלוח המצופה בקולגן והדגר את התאים עד להיווצרות מושבות ביום הראשון. לאחר ההדגרה, הסר באיטיות את המצע המנוצしたもの מהבארים באמצעות פיפט, מבלי להפריע לתאים בעלי ההיצמדות הרפויה.

לאחר מכן, הוסיפו בזהירות ארבעה מיליליטר של E GM two לבארים והחזירו את הפלטה לאינקובטור. מושבות מופיעות בדרך כלל בין הימים 5 ל-14, יום לפני הפרוצדורה. ב-50 microliters של קולגן מזנב חולדה.

הוסיפו אחת לכל באר בלוח 96 באערים כפי שנעשה קודם לכן, והדגירו את הלוח למשך הלילה ביום הפרוצדורה. התחילו בשטיפה כפולה עם PBS של תאים שעברו מעברים (passaging) פעמיים עד שלוש בלבד. לאחר שאיבת השטיפה האחרונה של PBS, הניחו צילינדר שיבוט סטרילי מצופה ג'ל מסביב לכל מושבה, תוך הצמדה חזקה של כל צילינדר ללוח באמצעות פינצטה סטרילית.

הוסיפו שתי עד שלוש טיפות של triple E express חמים לכל גליל שיבוט (cloning cylinder) והדגירו את הגלילים למשך שלוש עד חמש דקות עד שהתאים יתחילו להיפרד. לאחר שהתאים החלו להיפרד, הוסיפו בקירוב 250 µL של מצע EGM two למרכז הגליל ובצעו פיפטאג מעלה ומטה כדי ליצור סספנזיה של תאים בודדים. כעת העבירו את סספנזיית התאים הבודדים מכל גליל שיבוט בנפרד למבחנה מיקרו-צנטריפוגית אינדיבידואלית.

הדביקו את התאים בלוחית בעלת שש בארות באמצעות לנטיווירוסים המבטאים EGFP ואספו את התאים המבטאים EGFP באמצעות ציטומטריה פלורסצנטית. לאחר מכן, הדגרירו את התאים החיוביים ל-EGFP ו-EGM Two בלוחיות מצופות קולגן. כאשר ה-E CFCs מוכנים, אספו אותם באמצעות TrypLE Express כפי שהודגם כעת, וסספנדו מחדש את התאים במצע EGM Two לריכוז סופי של כ-10⁶ תאים למילליליטר.

לאחר מכן, באמצעות מיין תאים (flow sorter) בקצב זרימה נמוך של 20 תאים לשנייה, מיין תא ECFC בודד חיובי ל-EGP לכל באער בתוך פלטת 96 באערים מצופה קולגן שהוכנה מראש; התאם את הנפח הסופי של כל באער עם EGM two לכ-200 microliters לבאער. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך כדי לוודא שכל באער מכיל תא אחד בלבד. דגרי את הפלטה למשך שבועיים, כולל שתי החלפות מדיום, עד ליום ה-14 של התרבית.

שטפו כל באר עם 100 µL של PBS לפני קיבוע התאים באמצעות 100 µL של 4% paraformaldehyde למשך 30 דקות. עבור CFCs שאינם מבטאים EGFP, הוסיפו cyt reagent, צבע גרעיני פלואורסצנטי ירוק, לאחר הקיבוע ב-paraformaldehyde והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה. השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לכמת באופן חזותי את מספר התאים האנדותליאליים שהתרחבו; כפי שמוצג כאן, בארים עם מספר תאים אנדותליאליים של 2 עד 50 נחשבים לצברי תאים אנדותליאליים.

בארים המכילות 51 עד 2000 תאים נחשבות ל-e CFCs בעלי פוטנציאל פרוליפרטיבי נמוך, ובארים עם 2001 תאים ומעלה נחשבות ל-e CFCs בעלי פוטנציאל פרוליפרטיבי גבוה. לאחר ניתוק התאים באמצעות triple E express כפי שבוצע קודם לכן, קבעו את מספר התאים החיים בתרבית התאים באמצעות המוציטומטר וצבע trypan blue. העבירו 2.4 מיליון תאים חיים לשפופרת קונית של 50 מיליליטר, ולאחר מכן השקיפו את התאים באמצעות סבב צנטריפוגה.

ערבבו היטב את הרכיבים עבור מטריצת הג'ל ולאחר מכן התאימו את ה-pH ל-7.4 באמצעות נתרבן (sodium hydroxide), תוך שמירה על התמיסה על קרח. לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), השעיקו מחדש את המשקע ב-360 µL של e GM two חמים. לאחר מכן, הוסיפו 840 µL של תמיסת מטריצת הג'ל לתאים וערבבו את התמיסה בזהירות עד שהתאים מושעים לחלוטין בג'ל. העבירו ת сусפנזיה של ג'ל תאי זה בנפח של 1 mL לבאר אחת של פלטת תרבית רקמות בעלת 12 בארות, והדגירו את הפלטה עד להספגת (פולימריזציה) הג'ל.

לאחר מכן, לפני דגירה למשך לילה, כסו בעדינות את הג'ל ב-2 mL של EGM-2 חמים. למחרת, ומיד לפני ההשתלה, השתמשו במספרי איריס כדי לחלק את הג'ל לשני חלקים שווים והחזירו את חלקי הג'ל לאותה באר תרבית המכילה מצע EGM-2. לאחר אישור ההרדמה באמצעות צביטה בבהונות, גלחו את הבטן התחתונה של עכבר nude, skid הרדום בן חמישה עד שישה שבועות, ונקו ביסודיות את אזור הניתוח באמצעות פדים של אלכוהול ובטדין בתנועות סיבוביות.

בשלב הבא, השתמשו במספרי איריס חדים וסטריליים כדי לבצע חתך של כ-5 מילימטרים ברביע התחתון של הבטן, ובכך תחשפו את החלל התת-עורי שבין העור לשריר הבטן. בצעו דיסקציה קהה של שכבת העור מהשריר הבטני בשני אזורים שונים של הבטן כדי ליצור כיסים ברוחב 15 עד 20 מילימטרים, כאשר אחד מוביל כלפי מעלה לרביע העליון של הבטן והשני לאזור אחר בבטן. לאחר מכן, הרימו את שכבת העור בסמיכות לחתך.

החדירו חצי חלק מהג'ל לתוך כיס בטני אחד וחצי חלק נוסף מהג'ל לתוך הכיס הבטני השני. לאחר החדרת הג'לים, סגרו כל חתך בשתי עד שלוש תפרים באמצעות חוט תפר פוליפרופילן 5-0 על מחט חותכת. סמנו את כרטיסי הכלובים ובצעו ניטור לאחר הניתוח ומתן משככי כאבים בהתאם לדרישות המוסדיות ודרישות הפרוטוקול.

לאחר הקרבת בעל החיים ביום ה-14 להשתלה, נגב את בטנו של העכבר עם פדי אלכוהול וחתך את העור לאורך קו החיתוך המקורי. לאחר מכן, הסר מקרי עור מהמיקום המשוער של הג'לים. בצע חיתוכים היקפיים סביב הג'לים כדי להוציא כל שתל, ולאחר מכן העבר את השתלים שהוצאו למקבע אבץ.

באמצעות טכניקת הפקה זו של ECFC, צפינו בצמיחה של התפתחות מושבות ראשוניות כבר ביום החמישי. שימו לב למורפולוגיית ה-"cobblestone" (ריצוף) של תרביות ECFC אלו ביום החמישי, כפי שמצוין על ידי ראשי החיצים. מושבות שהתרחבו מבטאות אנטיגנים אנדותליאליים, אך אינן מבטאות אנטיגנים המטופואטיים.

כפי שמוצג בהערכה פנוטיפית מייצגת זו in vitro של תאי אנדותל ותאי המטופואטיים, אימונופנוטיפיה גילתה כי e CFCs מבטאים אנטיגנים אנדותליאליים כגון CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four, ו-NRP two, אך לא ביטאו אנטיגנים המטופואטיים, CD 45 CD 14, CD 11 BC Kit CXCR four או CD 1 33. באופן משמעותי, כפי שמוצג בגרף עמודות זה, מושבות מורחבות מציגות היררכיה מלאה של פוטנציאל פרוליפרטיבי קלונאלי ברמת התא הבודד, הנעה בין צבירי תאים של 2 עד 50 תאים ועד למושבות של יותר מ-200 תאים. מיקרוגרפים אלו של מושבות שצבעו ב-cyt, צבע גרעיני פלואורסצנטי ירוק, התקבלו לאחר ש-E CFCs המופקים מדם שרובי תורשתי תורבקו ברמת התא הבודד למשך 14 ימים.

יתרה מכך, ה-CFCs יוצרים כלי דם אנושיים המוזנים בתאי דם אדומים של המארח כאשר הם מושתלים בעכברים עם חסר חיסוני. בצביעה זו של H&E של שתלי ג'ל CELLULARIZE המכילים ECFC המופקים מדם טביליות, ניתן להבחין בכלי דם זעירים המלאים בתאי דם אדומים של המארח, אשר נוצרו בג'ל קולגן פיברונקטין לאחר 14 ימי השתלה. כאן, צביעת anti-human CD 31 בחום מאשרת עוד יותר את המקור האנושי של כלי דם אלו.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים ECFCs מדם חבל טבילה אנושי, וכיצד לשבט, להרחיב ולאפיין את התפקוד של מושבות ECFC לאחר פיתוחן. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האנדותל של כלי הדם לבחון את הפוטנציאל הפרוליפרטיבי הקלוני ואת הפוטנציאל הגנומי של תאים אנדותליים המופקים ממקורות מרובים.