טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות
22 במרץ 2012
המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.
סרטון זה מתאר פרוצדורה למעקב אחר אירועי איתות של קולטני תאי T באמצעות רכישה סימולטנית בערוץ כפול. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהחזר פנימי מלא, או מיקרוסקופיית TIRF. ראשית, תאי T עוברים טרנספקציה עם פלסמיד המקודד ל-ZAP 70 מתויג GFP. מכינים שכבה שומנית כפולה הנתמכת בזכוכית, המשלבת קומפלקסים של MHC עם פפטיד מעוגן לשומן, מולקולות היצמדות ומולקולות קו-סטימולטוריות.
תאי T שעברו טרנספקציה של ZAP 70 מתווספים לשכבה הכפולה כאשר קולטני תאי ה-T נקשרים לקומפלקסים של פפטיד-MHC. שרשראות ה-CD3 הקשורות לקולטן תאי ה-T עוברות פוספורילציה על ידי LCK, קינאז ממשפחת SARC, והקינאז zap 70 מגויס מהציטופלזמה. לאחר מכן, קולטן תאי ה-T מסומן פלואורסצנטית ומבוצע דימוי שבו התאים טבולים בתווך בעל מקדם שבירה נמוך יותר מזכוכית ה כיסוי, ומוארים על ידי קרן לייזר בזווית המעבירה השתקפות פנימית מלאה.
פעולה זו יוצרת גל חולף (evanescent wave) בממשק שבין הזכוכית למים, אשר דועך באופן מעריכי לתוך המדיום, דבר המאפשר עומק חדירה של 100 עד 200 nanometers. לפיכך, רק פלואורופורים השוהים בממברנה הפלסמית או בקרבתה עוררים. ניתוח התמונות שהתקבלות חושף כי האותות מועברים בתוך מיקרו-צבירים של קולטני תאי T.
היתרון המרכזי של מיקרוסקופיית TIRF או מיקרוסקופיית קונפוקלית קונבנציונלית הוא קבלת רזולוציה טובה יותר, המאפשרת ויזואליזציה קלה של צבירי איתות או קומפלקסים של איתות, כגון micro clusters של TCR. טראוויס קרייטס וצ'ן, שני פוסט-דוקטורנטים במעבדה שלי, ידגימו כיצד לבצע טרנספקציה לתאי T ראשוניים של עכבר באמצעות טכנולוגיית maxi nucleofection, ולאחר מכן לדמיין אותם באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בהחזרה פנימית מלאה (TIRF M) שעברו גרייה באמצעות שכבה דו-שכבית של ליפידים בגלל (glass of bird lipid bilayer) המכילה אנטיגן.
שיטה זו שימשה באופן נרחב לחקר העברת אותות בתאי חיסון שונים, כולל תאי T, תאי B, תאי NK ותאי מאסט. השיטה היא בעלת יישום רחב וניתן להשתמש בה לחקר של רוב מערכות הקולטנים בתאי יונקים, ובמיוחד כאשר העברת האותות מתרחשת בצבירים. אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות בתחילה, שכן תאי T קשים מאוד לטרנספקציה.
בנוסף, נדרש תיאום מדויק כדי שחיוניות תאי T ויעילות הטרנספקציה, איכות הבילר וכן כיול המיקרוסקופ יהיו ברמה הנדרשת. השלב הראשון של פרוצדורה זו הוא טרנספקציה של תאי T ראשוניים, נאיביים או כאלו שהופעלו in vitro, עם פלסמידי ביטוי ומולקולות איתות מקודדות המסומנות ב-GFP, תוך שימוש בערכת AM maxa mouse T-cell nucleo effector. כל תאי ה-T ששימשו במחקר זה ביטאו את ה-A-N-D-T-C-R המזהה את פפטיד MCC הנמצא במולקולת MHC IE של K. פרוצדורת הטרנספקציה המוצגת כאן מבוצעת בהתאם להמלצות היצרן.
עם זאת, מוצגים מספר טיפים לקידום חיוניות תאי ה-T לאחר הטרנספקציה. הן החיוניות והן יעילות הטרנספקציה גבוהות יותר בתאי T שהופעלו in vitro מאשר בתאים נאיביים, ועל כן, פרוטוקול זה משתמש בתאי T שהופעלו in vitro לפני התחלת העבודה. הכינו שני מיליליטר של מצע תאי-T מועשר עבור כל טרנספקציה, על ידי ערבוב של 1.9 מיליליטר מהמצע המסופק בערכה, 20 µL רכיב A, 20 µL רכיב B, ו-100 µL סרום בקר עוברי (fetal bovine serum) בתוך מבחנה של שני מיליליטר.
העבירו שני מיליליטרים של מצע לכל באער בלוח 12 באערים. הניחו את הלוח באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר למצע להגיע לשיווי משקל; מוות של תאים יתרחש כתוצאה מהשעיה (Resus suspension) של תאים שעברו טרנספקציה במצע קר או במצע שאינו ב-pH של 7.2. להכנת תערובת הטרנספקציה, ערבבו 82 microliters של תמיסת nucleo effector לתאי T של עכבר עם 18 microliters של supplement two וחמישה micrograms של plasmid DNA נקי מאנדוטוקסינים בריכוז שאינו נמוך מ-0.5 micrograms per microliter, וערבבו היטב על ידי תיפוף.
העבירו חמישה עד 10 מיליון תאים לפסת צנטריפוגה של 15 מיליליטר, וצנטריגו ב-75 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, השתמשו בשואב ואקום כדי להסיר כמה שיותר מהנוזל העליון (supernatant), כדי להשעות מחדש את משק התאים בתערובת הטרנספקציה; שאבו את משק התאים בעדינות ובאיטיות שלוש עד ארבע פעמים עד שלא יישארו גושי תאים גדולים. בעזרת פיפט, העבירו בזהירות את התמיה למכשיר amaxa vete מאושר, תוך הגבלה על היווצרות בועות.
הגדירו את תוכנית האפקטור הגרעיני qve select X 0 0 1 במכשיר האפקטור הגרעיני. הכניסו את ה-vete למחזיק ה-Q vete ולחצו על הכפתור כדי להפעיל את התוכנית שנבחרה. לאחר מכן, העבירו מיד את ה-vete ואת מצע התרבית שהגיע לשיווי המשקל למטריס (hood).
באמצעות הפפיט פלסטיק שסופק, הוסיפו כ-500 microliters של המצע שעבר שיווי משקל ל-vete. לאחר מכן, הוסיפו את תרחף התאים למצע בצלחת. הוסיפו את התרחף טיפה אחר טיפה.
דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות כדי לאפשר ביטוי ברמה נמוכה של החלבונים המסומנים ב-GFP ולמזער את הופעת ארטיפקטים הנובעים מביטוי יתר. בחלק זה, מתואר תהליך יישור המיקרוסקופ לצילום סימולטני בערוצים כפולים לפני הפעלת כל רכיבי המיקרוסקופ. הפעילו את המחשב ואת התוכנה.
לאחר מכן ודאו שכל רכיבי החומרה מזוהים על ידי התוכנה. מכיוון שהתוכנה נפתחת ללא הודעות שגיאה, כל הרכיבים זוהו. דללו מיקרוליטר אחד של תמיסת המהול
הוסף את המיקרוספירות הפלואורסצנטיות הרב-צבעיות של Flores לשני מיליליטר של PBS לשימוש כסטנדרט לקולוקליזציה. לאחר מכן, הוסף 0.25 מיליליטר מתלי suspension המיקרוספירות לכל באר במערכת כיסוי זכוכית בעלת שמונה תאים של lab tech. הנח את מערכת שקופיות התאים על הפלטפורמה מעל העדשה.
לאחר מכן, התמקדו בחרוזים הסופחים על הזכוכית בתצוגה המקדימה החיה. החלונית השמאלית היא הערוץ שבו יהיו נראות תאים שעברו טרנספקציה של GFP. החלונית הימנית תציג TCR מסומן במהלך ניסויי דימוי תאים חיים.
באמצעות כיוון Y של ה-XY, Z fiber launch, התאימו את מיקום קרן הלייזר כך שהקרן תצא מהעדשה ותושלך על התקרה. חשוב לבצע זאת כאשר העדשה נמצאת במיקום שבו מישור הזכוכית נמצא במיקוד. אם הקרן על התקרה מפוזרת, פירוש הדבר שהקרן אינה מקבילה (collated).
כווננו את המיקרומטר של ציר Z כדי להשיג כיול מלא (collation test) עבור כל אחד מקווי הלייזר שבהם יעשה שימוש בניסוי. לאחר מכן, באמצעות מד הספק לייזר, כווננו את הספק הלייזר ל-20 עד 30 micro watts עבור כל ערוץ. תאי T רגישים ביותר לקרינת לייזר, ולכן ההארה מוגבלת לסך כולל של 50 micro watts.
בשלב הבא נגדיר את הזווית עבור ה-turf. סובב את מיקרומטר יישור ציר Y במקור סיב האור כדי להרחיק את קרן האור מהתקרה, עד שהזווית שלו ביחס לציר האופטי של העדשות תתקרב ל-90 מעלות.
ברגע שמושגת הזווית הקריטית להחזרה פנימית מלאה, אור הלייזר לא יצא עוד מהעדשה. כדי להעריך אם הושגה יישור "דשא" (turf alignment), התמקדו מעל ומתחת למישור של זכוכית הכיסוי. שימו לב שכאשר החרוזים שנספחו לפני השטח יוצאים מהמיקוד, ניתן לראות חרוזים רבים צפים בתמיסה. כדי להשיג יישור דשא טוב, יש להגדיל את זווית הקרן ביחס לעדשה.
ככל שזווית הקרן גדלה, חרוצים הצפים סמוך לפני השטח מתחילים להיעלם ועוצמתם של החרוצים שנספחו לממשק עולה. כעת, כאשר החרוצים שנספחו לממשק מוצאים מהמיקוד, לא נותרים חרוצים צפים בתמיסה הנראים לעין. בנקודה זו, המערכת מיושרת כראוי, שכן רק החרוצים שנספחו לזכוכית הכיסוי יכולים להיות במיקוד.
בשלב הבא, כדי להגמיש את הערוצים הפלואורסצנטיים האדום והירוק זה ביחס לזה, התמקדו בחרוזים והשוו את המיקום של מאפיינים ניתנים לזיהוי בתמונות שהופקו בשני הערוצים. באמצעות ברגי המיקרומטר של ציר X ו-Y במעמד של אחת המצלמות, הגעיש את המיקום היחסי של החרוזים לסמיכות המקסימלית האפשרית. שימו לב לחרוז הבהיר ברביע השמאלי התחתון של שתי התמונות כדי להבטיח התאמה מרחבית בין שני הערוצים.
מאפיין זה מובא לאותה מיקום יחסי בשני התמונות. צלם ושמור את התמונה משני הערוצים. תמונות אלו ישמשו כסטנדרט לקולוקליזציה (colocalization) לצורך יישור של שני הערוצים.
דוגמה ליישור זה נראית כאן לפני ביצוע היישור. אחד הערוצים מסובב ביחס לשני, כפי שמוצג בתמונה זו שבה מוטלו תמונות משני הערוצים של חרוזי הסוב-רזולוציה. לאחר ביצוע הכיוונים, התמונות מיושרות כפי שמוצג כאן.
ניתן לבחון באופן מעמיק יותר את איכות היישור על ידי השוואת תמונות של תאים חיים שעברו טרנספקציה של GFP. שימו לב כי הפודיום של Laila משני הערוצים מיושר באופן מושלם, לאחר יישור שתי התמונות באמצעות הכיול שנקבע בעזרת המיקרו-חרוזי הפלורסצנטים.
לאחר הגדרת המיקרוסקופ, מכינים תאי זרימה המכילים שכבות ליפידים דו-שכבתיות נתמכות בזכוכית המציגות אנטיגן, ומבצעים turf M כדי להנחית תחילה תאי T שעברו טרנספקציה המקיימים אינטראקציה עם התשתית. בהתאם לפרוטוקול שתיארו Ana ו-Dustin, מרכיבים תא זרימה עם שכבות ליפידים דו-שכבתיות מישוריות שנוצרו על כיסוי זכוכית המכיל ליפידי NI NTA, את מולקולת ההצמדה ICAM 1 וקומפלקסים של pMHC.
המוולקולה הקו-סטימולטורית CD 80 מוטמעת. באמצעות עיגון GPI, מקמו את תא הזרימה על במה של המיקרוסקופ וייצבו אותו על ידי חיבור התא ללוח מתאם על במת המיקרוסקופ באמצעות מוט מתיחה כדי לקבע אותו. לאחר מכן, חברו את גוף החימום המסופק על ידי היצרן לתא הזרימה כדי לשלוט בטמפרטורה שלו.
מקם את העדשה על השכבה הכפולה והגדר את מיקוד מישור השכבה הכפולה כדי לאפשר חימום של העדשה ותא הזרימה; הפעל את מחממי תא הזרימה והעדשה כדי להביא את טמפרטורת התא ל-37 °C. לאחר ארבע שעות של דגירה, העבר את תאי ה-T שעברו חיתוך לשפופרת של 15 mL וסבב במערך צנטריפוגה במהירות של 80 ×g. השהה מחדש את התאים ב-300 µL של בופר H-B-S-B-S-A. לאחר מכן, הוסף H 57 FAB או fragmet של שרשרת משתנה בודדת של H 57 לסמן את ה-TCR בריכוז סופי של 10 µg/mL עבור fab או 20 µg/mL עבור ה-fragment של השרשרת המשתנה הבודדת.
העבירו את התאים לפ menutup פקס של 5 מיליליטר. לאחר מכן, בעזרת מזרק עם טיפ של 1 מיליליטר, הזרקו את התאים לתא הזרימה באמצעות שסתום תלת-כיווני. הגדירו את תנאי הדימות כך שרכישת התמונה בזמן אמת בערוץ הכפול תציג תצוגה מקדימה חיה של ערוצי ה-TCR וה-GFP, ואיתרו שדה עם תאים שעברו טרנספקציה.
בשל הבדלי העוצמה בין ה-TCR ל-GFP, ייתכן שיהיה צורך להתאים את קנה המידה של התמונות בזמן אמת כדי שניתן יהיה להדמיות את התאים בשני הערוצים. כפי שקורה כאן, יש לאשר את תאורת ה-turf על ידי מיקוד כלפי מעלה של מישור הזכוכית כדי לזהות כל צביעה של ממברנה לטראלית. אם הממברנות הלטראליות אינן נכנסות למיקוד, הרי שיישור ה-turf תקין.
בתצוגה חיה זו, צביעת ממברנה לטרלית ניכרת הן במישור של זכוכית הבידוד (cover slip) והן כאשר זכוכית הבידוד מוצאת מהמיקוד כדי להביא את המיקרוסקופ להתאמה טובה של ה-turf. הזווית של הלייזר ביחס לעדשה אובייקטיבית גדלה, והממברנה הלטרלית יוצאת מהמיקוד. התחילו ללכוד תמונות בודדות ורצפי time-lapse במרווחים של 10 שניות.
במשך חמש דקות, התאים הודגרו על תמיכות זכוכית ושכבות דומיניות (bilayers) של INTA המכילות שש מולקולות למיקרומטר רבוע של פפטיד טעון ב-His-tag IEFK, 100 מולקולות למיקרומטר רבוע של ICAM-1 טעון ב-His-tag ומצומד ל-Alexa 647, ו-100 מולקולות למיקרומטר רבוע של CD80 מעוגן ל-GPI. ביצוע מיקרוסקופיית TIRF עם רכישה סימולטנית בערוץ כפול בוצע בנוכחות רציפה של פרגמנט FAB של H57 מצומד ל-Alexa 546.
כדי לצבוע את ה-TCR, התאים צולמו עד שעה לאחר המגע הראשוני עם השכבה הכפולה. מספר מקבצי ה-ZAP 70 לכל תא נותח באמצעות תוכנה אוטומטית לספירת מקבצים. בכל מקרה נותחו לפחות 40 תאים.
הפפטידים שהוטענו מצוינים בתוך התמונה. ICAM one מתייחס לתאים על שכבות דו-שכבתיות המכילות 100 מולקולות למיקרומטר רבוע של Alexa 6 4 7 מסומן. ICAM one עם תג His, כפי שמוצג באיור, סיגנל תלוי zap 70 מתרחש במיקרו-צברים של TCR ורק בתגובה לליגנדים אגוניסטים, כפי שניתן לראות בסרטון זה, שצולם בפרמטר של 10 שניות לפריים.
אותת ה-TCR בתגובה לפפטידים אגוניסטיים נשמרת על ידי יצירה רציפה של מיקרו-צבירים (micro clusters) של TCR בפריפריה של אזור המגע, אשר מגייסים את ZAP 70. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה לגבי אופן הטרנספקציה של תאי T ראשוניים באמצעות טכנולוגיית maxa nuclear affection, וכיצד לבצע דימוג נכון של גיוס מולקולות אותת GFPT למיקרו-צבירי TCR באמצעות מיקרוסקופיית turf. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבע שעות במידה והיא מבוצעת כראוי.
במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לה待תייחס בעדינות רבה לתאים הראשוניים. ככל שהתאים יהיו בריאים יותר בכל שלב של הניסוי, כך תהיה יעילות הטרנספקציה גבוהה יותר ומספר התאים שיילקטו בדימיון יהיה רב יותר. תאי T הם ניידים מאוד, וכתוצאה מכך, דימיון רציף של ערוץ ה-TCR וערוץ ה-GFP גורם לכך ששתי התמונות לא יתיישרו באופן מושלם בשל תנועתם של תאי ה-T ושל מיקרו-צבירי ה-TCR.
כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו את מיקרוסקופ ה-turf לרכישה סימולטנית בערוץ כפול.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למעקב אחר אירועי איתות של רצפטורים של תאי T באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בהחזרה פנימית מלאה (TIRF). טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה של קומפלקסי איתות בתאי T, ומספקת תובנות לגבי הדינמיקה המרחבית והזמנית של אינטראקציות בין חלבונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי מוח
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- הבנת המדורה התאית של חלבונים היא חיונית למחקר של מסלולי איתות.
- מיקרוסקופיית TIRF מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות בין חלבונים.
- אירועי איתות בתאי T חיוניים לתגובות חיסוניות.
- בשיטות קודמות חסרה הרזולוציה הדרושה להדמיה יעילה של מיקרו-צבירים (microclusters).
מטרת המחקר
- להדגים מערכת מבוססת מיקרוסקופיית TIRF לחקר סיגנלינג של קולטני תאי T.
- לספק פרוטוקול לטרנספקציה של תאי T עם מולקולות סיגנלינג המסומנות ב-GFP.
- להדגיש את היתרונות של מיקרוסקופיית TIRF על פני שיטות קונבנציונליות.
שיטות בשימוש
- טרנספקציה של תאי T ראשוניים של עכבר עם ZAP-70 המסומן ב-GFP.
- הכנה של שכבה ליפידית דו-שכבתית נתמכת בזכוכית עם קומפלקסים של פפטיד-MHC.
- דימות באמצעות מיקרוסקופיית TIRF להדמיית מיקרו-צבירים של קולטן תאי T.
- ניתוח של אירועי איתות באמצעות רכישה סימולטנית בערוץ כפול.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של מיקרו-צבירים (microclusters) של קולטני תאי T במהלך העברה של אותות.
- הדגמה של רזולוציה משופרת במיקרוסקופיית TIRF בהשוואה למיקרוסקופיית קונפוקלית.
- זיהוי אירועי העברת אותות מרכזיים ואינטראקציות בין חלבונים בתאי T.
- מתן טיפים לפרוטוקול לשיפור חיוניות תאי T ויעילות הטרנספקציה.
מסקנות
- מיקרוסקופיית TIRF היא כלי רב עוצמה לחקר דינמיקת האיתות של תאי T.
- השיטה ישימה באופן רחב למערכות קולטן שונות בתאי יונקים.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לבחון איתות בתאי מערכת החיסון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
טכניקת מיקרוסקופיית TIRF זו מאפשרת דימוי בו-זמני ובזמן אמת של TCR ושל חלבוני איתות הקשורים אליו, ומספקת רזולוציה מרחבית וזמנית קריטית לאישור יעדים בשלבים מוקדמים באימונולוגיה. באמצעות ויזואליזציה של היווצרות מיקרו-צבירים של TCR ואירועי איתות במורד המסלול, כגון גיוס של Zap70, השיטה תומכת בהורדת סיכונים מכניסטית של השערות טיפוליות הכוללות מסלולי הפעלה של תאי T. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מובילים (leads) על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על אינטראקציות בין חלבונים בממברנת הפלזמה תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות לגבי שילוח TCR על ידי ויזואליזציה של גיוס בזמן אמת של חלבוני שילוח כגון Zap70 למיקרו-צבירים של TCR.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על הפעלת קינאז ופוספורילציה של חלבוני מתאם בתאי T חיים.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון בבחירת המטרה על ידי קישור בין מעורבות הליגנד לבין היווצרות קומפלקס שילוח במורד המסלול, באמצעות קריאה כמותית מבוססת דימוי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטים כמותיים וסטנדרטיים, כגון ספירת אשכולות Zap70 לתא באמצעות אנליזה אוטומטית, מה שמאפשר תנאי סריקה הניתנים לשחזור.
- סקילביליות: רכישה סימולטנית בערוץ כפול מאפשרת ניטור מקבילי של מעורבות רצפטורים וגיוס חלבוני סיגנלינג, ובכך משפרת את התפזורה להערכת תרכובות או ליגנדים.
- שחזור: פרוטוקולים ליישור המיקרוסקופ באמצעות סטנדרטים של מיקרו-ספירות פלואורסצנטיות מבטיחים רישום ערוצים עקבי בין ניסויים ומשתמשים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין השלב המוקדם של הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה לבחינת דינמיקת האותות של TCR תחת תנאי גירוי מוגדרים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהירה האם האותות שנצפו תלויים בליגנדים אגוניסטיים והאם הם מתרחשים באופן ספציפי במיקרו-צבירי TCR, ובכך מפחיתה עמימות בפירוש המסלול.
- סנכרון עם סמנים ביולוגיים: תומכת בזיהוי אירועי העברה של אותות התלויים בפוספורילציה, שעשויים להיות במתאם עם תגובות פונקציונליות של תאי T ותוצאות התמיינות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל ממעורבות המטרה (target engagement) ועד לאופטימיזציה מוקדמת של מובילים (lead optimization), ובמיוחד עבור אימונו-מודולטורים המשפיעים על סיגנלינג של קולטן T-cell.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות להדמיה של הארגון המרחבי והדינמיקה הזמנית של קומפלקסי איתות הקשורים ל-TCR.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות מבוססות הדמיה (למשל, היווצרות אשכולות Zap70) התומכות בהשוואה בין יעילות ליגנדים שונים או הפרעות גנטיות.
- אנליזה: מספקת תוצאות רב-ערוציות וסימולטניות של מיקום קולטנים וגיוס חלבוני איתות, מה שמאפשר קורלציה בין המעורבות להפעלה.
- מחקר תרגומי: תומך ברציפות פרה-קלינית על ידי מידול של היווצרות סינפסה אימונולוגית על שכבות ליפידיות נתמכות עם הצגת אנטיגן מוגדרת.
- שימוש חוזר בארגון: ניתן להתאמה למערכות קולטנים שונות בתאי יונקים שבהן איתות מתרחש באשכולות, ובכך מקדם תועלת חוצת-פרויקטים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באותות TCR על ידי ויזואליזציה ישירה של גיוס Zap70 למיקרו-צבירים (microclusters) בעת קישור לאגוניסט.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולי טרנספקציה סטנדרטיים, הכנת שכבת ליפידים דו-שכבתית והליכים ליישור ערוץ כפול.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go בפיתוח אימונותרפיה על ידי אספקת תובנה מכניסטית מוקדמת לגבי קישור למטרה ויצירת אות.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעודוף של מועמדים המכוונים ל-TCR בהתאם לסיכון, על בסיס כשירות אותית מאושרת במערכת המקשורה להקשר פיזיולוגי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטרנספקציה של תאי T ראשוניים ובדימיון של תאים חיים תחת תנאים סביבתיים מבוקרים.
- תלוי במערך מיקרוסקופיה התואם ל-TIRF עם יכולת רכישה בו-זמנית של שני ערוצים ודיוק בכיול הלייזר.
- מחייב סטנדרטיזציה של הרכב השכבה הליפידית והצגת האנטיגן כדי להבטיח מעורבות עקבית של TCR לאורך הניסויים.
- כולל אופטימיזציה של יעילות הטרנספקציה והחיוניות, במיוחד בהתחשב ברגישותם של תאי T ראשוניים למניפולציות ולארטיפקטים של ביטוי-יתר.
- מוגבל על ידי הצורך בטיפול עדין כדי לשמור על חיוניות התאים ולמנוע אי-דיוק בכיול הנגרם מסחיפה במהלך דימיון Time-lapse.
