Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

המטרה הכללית של הליך זה היא להשיג מעקב סטנדרטי אחר ההתנהגות in vivo של תאי גזע שהושתלו במוח של עכבר. מטרה זו מושגת תחילה על ידי סימון תאי סטרומה ממח העצם, אשר ביטאו במקביל EGFP ולוסיפרז, באמצעות חלקיקי תחמוצת ברזל פלורסצנטיים בגודל מיקרוני. השלב השני הוא הזרקה נכונה של תאי BMC המסומנים ב-MPIO לרקמת המוח של העכבר.

שמישי, עוקבים באופן לא פולשני אחר ההישרדות והמיקום של השתולי התאים באמצעות דימות ביו-לומינצנציה ודימות תהודה מגנטית. השלב האחרון הוא תיקוף של תוצאות הדימות in vivo באמצעות אנליזה היסטולוגית לאחר המוות. שיטות אלו יכולות לספק תובנה לגבי התנהגות תאי גזע לאחר השתלה במוח העכבר, אך ניתן להחלין אותן גם במערכות אחרות, כגון אורגניזמי מודל ומחקרים של מחלות.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי הטיפול בבעלי החיים קשה ללמוד מכיוון שהזרקות תוך-ורידיות ותוך-מוחיות הן קשות לביצוע וכרוכות בסיכונים מסוימים להישרדות בעלי החיים. כדי להתחיל בהליך זה, יש להוסיף 75 times 10 to the six של חלקיקי תחמוצת ברזל בגודל מיקרוני בצבע כחול קרחון לתרבית תאים גדלה שאינה תופסת את כל שטח המצע (sub confluent). יש להדגיר אותם למשך 16 שעות נוספות כדי לאפשר ספיגה של החלקיקים באמצעות אנדוציטוזיס, ולאחר מכן לשטוף את החלקיקים הנותרים.

אפשרו לתאים לגדול למשך 24 שעות נוספות כדי להגיע לקונפלואנציה של התאים ולהתפלגות הומוגנית של ה-G-B-M-P-I-O. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לאמת חזותית את ספיגת החלקיקים על ידי חישוב היחס בין תאים חיוביים ל-EGFP וחיוביים ל-G-B-M-P-I-O למספר הכולל של תאים חיוביים ל-EGFP. לאחר מכן, שטפו פעמיים 10 מיליליטר של תאי BMSC luciferase EGFP המסומנים ב-G-B-M-P-I-O.

טפל בתאים ב-tripsin EDTA ובצע קציר של התאים לאחר מכן. שטוף את התאים והשעה אותם מחדש בריכוז סופי של 133 times 10 to the sixth תאים למיליליטר ב-PBS. לבסוף, שמור את התאים על קרח עד להשתחלה.

בנוהל זה, הרדימו את העכבר על ידי הזרקה תוך-peritonal של תערובת של ketamine בריכוז 80 milligrams per kilogram ו-xylazine בריכוז 16 milligrams per kilogram. המתינו חמש דקות עד שהעכבר יירדם, ולאחר מכן גלחו את ראשו כדי לאפשר מניפולציות סטריליות. לאחר מכן מקמו את העכבר במסגרת סטריאוטקטית וחטאו את העור באלכוהול.

לאחר מכן, מרחו משחה בעיניו כדי למנוע התייבשות. בצעו חתך בקו האמצע של קרקומת הראש כדי לחשוף את הגולגולת במטרה להגיע להיפוקמפוס. קדחו חור בגולגולת במיקום של שני מילימטרים אחורית ושני מילימטרים צדית באמצעות מקדח שיניים.

בשלב זה, ערבלו את תרחיף התאים קצרה באמצעות וורטקס, ולאחר מכן שאבו את תרחיף התאים למזרק. לאחר מכן, הורידו את מחט המזרק לעומק של 2.5 millimeters מתחת לקשיה (dura) והמתינו דקה אחת להשוואת לחצים. לאחר דקה, החזירו את המחט למיקום של שני מילימטרים מתחת לקשיה.

לאחר מכן, הזרק 3 µL מתלי תאים באמצעות משאבת מיקרו-הזרקה אוטומטית במהירות של 0.70 µL לדקה. לאחר ההזרקה, המתן חמש דקות נוספות כדי למנוע נסוגיות של תלי התאים שהוזרקו. לאחר מכן, משוך את המחט לאחור באיטיות.

לאחר מכן, חטאו את שולי העור ואז תפרו את העור. מזריקו 300 µL של תמיסת sodium chloride 0.9% תת-עורית כדי למנוע התייבשות. לסיום, הניחו את העכבר תחת מנורת חימום כדי לאפשר התאוששות מההרדמה לצורך ביצוע דימות ביולומינצנציה.

הרדמה של העכבר באמצעות תערובת של 3% isoflurane וחמצן. לאחר מכן, הנח את העכבר במכשיר הדימות הפוטוני (photon imager). הפחת את רמת ההרדמה על ידי כיוון ה-isoflurane ל-1.5%. לאחר מכן, הזרק d-Luciferin לווריד במינון של 150 mg/kg למשקל גוף.

רכשו תמונה למשך חמש דקות באמצעות התוכנה photo vision. לאחר מכן, בצעו עיבוד תמונה באמצעות התוכנה M three vision וכממו את האות שנצפה באמצעות אזורי עניין (regions of interest) קבועים. לביצוע דימות תהודה מגנטית (MRI), הרדימו את העכבר עם 3% ISO fluorine בתערובת של חמצן וחנקן מונוקסייד.

לאחר מכן, מקם את העכבר במקבע של מערכת MR אופקית בעוצמה של 9.4 Tesla. הפחת את רמת ההרדמה על ידי כיוון ה-isof fluorine ל-1%. לאחר מכן, מרח משחה על עיני העכבר כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, השתמש בגשושית רקטלית לניטור טמפרטורת הגוף.

לאחר מכן, הניחו חיישן מתחת לבטנו של העכבר כדי לנטר את קצב הנשימה. שמרו על קצב נשימה של 110 פלוס או מינוס 10 פעמים לדקה, והקפידו על טמפרטורת גוף קבועה בטווח צר של 37 פלוס או מינוס 0.5 °C. לאחר מכן, הניחו את סליל ה-RF השטחי על ראשו של העכבר.

מקם את העכבר במרכז המגנט. לאחר מכן פתח את תוכנת ParaVision 5.1. הגדר את פרמטרי הרצף בהתאם לכתב היד המצורף. לאחר מכן, רכוש סט של 10 דמויות spin echo שוקל T2 בחתך קורונלי כדי לקבל מידע אנטומי ספציפי.

ביצוע הדמיות gradient echo שוקללות בשיטת two star כדי לחקור נדידה של תאי גזע ברזולוציה של 70 micrometers squared. בשלב זה, יש להקריב את העכבר ולהוציא את המוח. קבע את רקמת המוח בטמפרטורת החדר ב-4%paraldehyde ב-PBS למשך שעתיים.

לאחר שעתיים, ייבשו את רקמת המוח על ידי הנחתה בריכוזים שונים של סוכרוז בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, הקפיאו את רקמת המוח באמצעות חנקן נוזלי ואחסנו את הרקמה בטמפרטורה של 80- °C עד לביצוע החיתוך.

בצעו חיתוך של רקמת המוח לפרוסות בעובי 10 µm באמצעות קריוסטט. לאחר מכן, סרקו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה את פרוסות הקריו שלא נצבעו כדי לאתר פלואורסצנציה כחולה מחלקיקי G-B-M-P-I-O ופלואורסצנציה ירוקה מהתאים המבטאים EGFP. לאחר מכן, סרקו את פרוסות הקריו שלא נצבעו כדי לאתר פלואורסצנציה רקע אדומה-ירוקה מהתאים הדלקתיים.

פרוצדורת הסימון ב-MPIO glacial blue המתוארת גורמת לסימון יעיל ביותר של תאי BMSC, תאי luciferase EGFP, שניתן לאשש בקלות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר מכן, עם השתלת G-B-M-P-I-O, תאי BMSC מסומנים ותאי luciferase EGFP למערכת העצבים המרכזית (CNS) של עכברים, ניתן לנטר את הישרדות השתל התאי באמצעות דימות ביולומינצנציה in vivo המבוסס על פעילות luciferase. בנוסף, ניתן לנטר את המיקום המדויק של התאים המושתלים באמצעות דימות תהודה מגנטית (MRI) in vivo המבוסס על תכולת הברזל של ה-MPIO glacial blue.

לבסוף, ניתוח היסטולוגי מדגים את תיקוף התוצאות שהתקבלו מדימיון בביולומינסנציה מדימות תהודה מגנטית. הישרדות יציבה אוששה על ידי ביטוי יציב של EGFP לאורך זמן לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הדימיון המולקולרי לחקור אירועים תאיים ומולקולריים לאחר השתלת תאי גזע במודלים שונים של בעלי חיים למחלות נוירודגנרטיביות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ביצוע דימות מולקולרי, תוך שימוש בביולומינסנציה ובדימות תהודה מגנטית, ובאופן שבו ניתן לתקף נכון תוצאות in vivo באמצעות הערכה היסטולוגית לאחר המוות.