תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להקליט תגובות של יחידות בודדות (single unit responses) in vivo מאוכלוסייה מזוהה של נוירונים במערכת מודל לא גנטית. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע קרניאוטומיה כדי לחשוף את אזור המוח הרלוונטי. השלב השני הוא שימוש בחוטי טונגסטן כדי להניח את הצבע הפלורסצנטי באזור אליו מקרינים הנוירונים המהווים את היעד.

בשלב הבא, הצבע עובר תעתוק רטרוגרדי, מה שמוביל לסימון סלקטיבי של נוירוני ההקרנה. השלב הסופי הוא הקלטה מהאקסון המסומן של נוירון הקרנה בודד. בסופו של דבר, הקלטות חוץ-תאיות של יחידה בודדת (single unit extracellular recordings) משמשות להדגמת האופן שבו נוירונים תחושתיים מרכזיים במעגל שלם מגיבים לגירוי התחושתי ב-evo.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לאופן שבו מעגלים עצביים מזהים הבדלים של פחות ממילישנייה בעיתוי של קלטים סינפטיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא היכולת להכווין את הפעולה לתאי עצב בודדים, או אפילו לאקסונים ולמערכות שאינן נגישות גנטית. דגים חשמליים שבועיים משתמשים באותות חשמליים לצורך תקשורת וניווט.

הם מבדילים בין אותות מדגים שונים באמצעות הפרשים של פחות ממילישנייה בעיתוי של קלטים סינפטיים. שאלנו כיצד נוירוני השוואת הזמן המשוערים במעגל החושי החשמלי שלהם מסוגלים לזהות הפרשי עיתוי קטנים כל כך. עם זאת, ניתן להחיל טכניקה זו גם על מערכות אחרות, כגון נתיבים חושיים חזותיים ושמיעתיים.

קשה במיוחד לבודד תאים אלו בשל גודלם הקטן, הצפיפות הגבוהה ברקמה המקיפה אותם והטרמינלים הפרה-סינפטיים המכסים את מרבית גוף התא. הזרקת צבע תוך-תאי במהלך הקלטת תא שלם (whole cell recording) במצב in vitro מסמנת תא בודד כדי להנחות הקלטות ממוקדות מאותו אקסון. באופן דומה, הובלה רטרוגרדית בעקבות הזרקת צבע חוץ-תאית מספקת אמצעי לסמימן סלקטיבית של נוירוני היטל באזורי מוח שטחיים.

ניתן להשתמש בכך כדי לספק הנחיה ויזואלית להקלטות של יחידה בודדת in vivo. כדי להכין את המחט המקודדת ב-D, ראשית בצעו השחזה אלקטרוליטית לחוט טונגסטן בעובי 160 µm עד לקוטר קצה מחט סופי של 5 עד 50 µm. לאחר מכן, בלילה שלפני הניסוי, קדדו את קצה המחט באמצעות תמיסה של 2 mM של צבע Alexa fluor מקושר לדקסטראן בעלות מולקולרית של 10,000 Da כדי להשרות הרדמה כללית.

הנח את הדג במי מכל עם תמיסת MS 2 22 בריכוז של 300 milligrams per liter; השבת את הדג והשתק אותו חשמלית על ידי הזרקת 100 microliters של flail בריכוז של three milligrams per milliliter לשרירי הגב (dorsal body musculature). לאחר מכן, מלא את תא ההקלטה במי מכל והנח את הדג כשהצד הבטני (ventral side) פונה כלפי מטה על הפלטפורמה שבמרכז התא. לאחר מכן, ספק את תמיסת MS 2 22 המאווררת בריכוז של 100 milligrams per liter בקצב של one to two milliliters per minute על ידי הנחת קצה פיפטה בפי הדג.

לאחר מכן, ייסבו את הדג באמצעות מוטות קיבוע ושעווה משני צידי הגוף. עקבו אחר מצבו הבריאותי של הדג על ידי בדיקת זרימת דם רציפה בכלי הדם העיניים וצבע גוף תקין. לאחר מכן, סובבו את הפלטפורמה סביב הציר האנכי.

כווננו קצה אחד של הפלטפורמה כך שצד אחד של פני השטח הגבייים של ראש הדג יהיה חשוף מעל המים, בעוד ששאר גוף הדג יישאר טבול. הניחו פיסה קטנה של Kim wipe על כל חלק שאינו טבול בעור כדי למנוע התייבשות. בהליך זה, מרחו lidocaine בריכוז 0.4% על פני השטח החשופים של הראש באמצעות מקל צמר גפן (Q-tip).

לאחר מכן, השתמש בלהב סקלפל כדי לחתוך פיסת רקמת עור מלבנית בגודל של כ-3 מילימטרים על 5 מילימטרים עבור דג באורך 6.2 סנטימטרים. הקצה הלטרלי של המלבן צריך להיות מיושר עם מרכז העין. הקצה האנטריורי של המלבן צריך להיות ממש מאחורי העין, והקצה המדיאלי של המלבן צריך להיות ממש לטרלית לקו האמצע.

לאחר מכן, הסר את המלבן באמצעות פינצטה. גזור ריבוע נוסף של 2.5 millimeter קדמה כדי לחשוף את הגולגולת. נקה לחלוטין את פני השטח החשופים של הגולגולת על ידי גירוד רקמה עודפת באמצעות להב הסקלפל.

לאחר מכן, ייבשו לחלוטין את הפני השטח באמצעות נייר ניקוי מסוג Kim wipe ואוויר דחוס. בשלב הבא, הדביקו מוט מתכת לאזור הגולגולת החשוף במקטע המדיאלי-קדמי (anterior medial) באמצעות דבק מהיר. המתינו עד שהדבק יתייבש לחלוטין.

השתמשו במקדחה דנטלית עם ראש קרביד כדורי בקוטר 0.5 millimeter כדי לסמן מלבן של כ-two millimeters על four millimeters על הגולגולת של דג באורך 6.2 centimeter. לאחר מכן, חתכו את היקף המלבן באמצעות סקאלפל ופינצטה. לאחר מכן, קלפו את הגולגולת והסירו אותה.

כדי לחשוף את המוח, גזרו הן את הקרומיות העבה (dura mater) הפיגמנטית והן את הקרומיות הרכה (pia mater) השקופה באמצעות מספרי קפיץ או מחט. לאחר מכן, הסירו את החלקים שנגזרו באמצעות פינצטה כדי לחשוף את הגרעין החיצוני-צדי הקדמי (anterior extra lateral nucleus) ואת הגרעין החיצוני-צדי האחורי (posterior extra lateral nucleus). כעת, מקמו זרוע מניפולטור עם מחט מצופה D שהוכנה מראש מעל אזור המטרה המכיל את האקסונים הרלוונטיים.

במקרה שלנו, יש להחדיר במהירות את המחט בעומק של כ-25 micrometers אל תוך הרקמה של הגרעין הפוסטריורי אקסטרה-לטרלי (posterior extra lateral nucleus). לאחר שהצבע התפשט במשך 15 עד 30 שניות, יש לשלוף את המחט. חזור על הפעולה עם מחטים נקיות נוספות לפי הצורך.

הניחו כל אחד מהם במיקום שונה כך שהצבע יתפזר בכל רחבי אזור המטרה. לאחר מכן, שטפו את עודפי הצבע מהחלל באמצעות תמיסת Ringer של Hickman והמתינו לפחות שעתיים לספיגה ולהובלה של הצבע. כדי להדמיאן את האקסונים הרלוונטיים, הניחו את תא ההקלטה עם הדג מתחת לעדשה של מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence) עם במה קבועה ומבנה אנכי.

החליפו את תמיסת הנשימה למי מכל טריים ושמרו על אותו קצב זרימה. לאחר מכן, מקמו קצה אחד של חוט ההארקה בחלל המוח החשוף וחברו את הקצה השני להארקה של ראש ההקלטה. לאחר מכן, מקמו זוג אלקטרודות הקלטה לצד בסיס הזנב.

לאחר מכן, חברו את האלקטרודות למגבר דיפרנציאלי ולמכשיר הקלטה. כדי לנטר את פקודת הפריקה של האיבר החשמלי (EODC), הכינו שרטוט בקנה מידה של אזור המוח כפי שנראה בהגדלה נמוכה, כולל כלי דם ראשיים כנקודות ייחוס לזיהוי המיקום המדויק של אקסונים מסומנים. כדי לאשר תחילה את מיקום ה-D, התבוננו בכל הרקמה תחת תאורת שדה בהיר (brightfield) לצורך התמצאות.

לאחר מכן, הדמיין את הדגימה באמצעות תאורה פלואורסצנטית. הגרעין הצידי-חיצוני האחורי (posterior extra lateral nucleus) אמור להראות סימון דיפוזי. לאחר מכן, תחת הגדלה גבוהה, אתר את הגרעין הצידי-חיצוני הקדמי (anterior extra lateral nucleus) בעזרת כלי הדם כנקודות ציון.

האירו את הדגימה באור פלואורסצנטי תוך כדי חיפוש אחרי אקסון מסומן סמוך לפני השטח, באמצעות קפילרה מזכוכית בורוסיליקט בעלת קוטר חיצוני של 1 millimeter וקוטר פנימי של 0.58 millimeter עם פילמנט. משוךת אלקטרודת רישום בעלת גבעול צר באורך של 5 millimeter וקוטר קצה של כ-1 עד 2.4 micrometers.

מלאו את האלקטרודה בתמיסת Hickman's ringer מסוננת. התנגדות הקצה הסופית צריכה להיות בטווח של 16 עד 155 mega ohms. מקמו את האלקטרודה במחזיק אלקטרודות עם פתח ללחץ.

חברו אותו לשלב הראש (head stage) המותקן על מניפולטור. לאחר מכן, חברו את שלב הראש למגבר. התקן רכישת אות אנלוגי-לדיגיטלי, שאינו מוצג, מחבר את המגבר למחשב.

לאחר מכן, הפעל לחץ חיובי של 30 millibar בקו האלקטרודה. התקדם באלקטרודה לאט לכיוון האקסון מפני השטח של הרקמה. כאשר האלקטרודה קרובה לאקסון, הלחץ החיובי אמור לגרום לתנועה קלה אך ניכרת של האקסון בזמן שהאלקטרודה נמצאת לצדו.

הקליטו את הפעילות במהלך הצגת גירויי הבדיקה. למרות שארטיפקט חשמלי מאשר הקלטה וגירוי תקינים, לא אמורים להופיע פוטנציאלי פעולה. שחררו את הלחץ החיצוני באלקטרודה וחזרו על הגירוי וההקלטה.

לאחר מכן, הפעילו יניקה קלה שתגרום לאקסון לנוע אל תוך האלקטרודה. חזרו על הגירוי וההקלטה פעם נוספת. כעת אתם אמורים לראות פוטנציאלי פעולה כתגובה לגירויים.

ברגע שפוטנציאלי הפעולה נראים, סגרו את קו הלחץ. כאשר כל ההקלטות הרצויות הושלמו, החזירו את מי המיכל לתמיסת נשימה עם MS 2 22 בריכוז של 100 mg/L כדי להבטיח שהדג הרדום לחלוטין. אין לזהות EODC למשך 10 דקות לפחות לפני ביצוע ההמתה לדג.

להלן חמישה דגימות של רישומים המראים את פוטנציאלי הפעולה שעוררו גירויי פולס ריבועי רוחבי חיובי קונטרלטרלי, מונופאזיים, בעוצמה של 6 millivolts per centimeter ובמשך 0.1 millisecond, וכאן מוצגת תרשים ראסטר (raster plot) המראה את זמני הספייקים במהלך 20 חזרות של חלון הקלטה של 75 millisecond עבור אותה יחידה שגורתה בזמן אפס עם גירויים של 6 millivolts per centimeter. טווח המשכים רשום מצד ימין. כאן מוצגת עקומת כוונון של משך הגירוי המכמתת את התגובות כמספר ספייקים לכל חזרה של הגירוי.

לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את הניתוח ואת הזרקת הצבע המוצגים בטכניקה זו תוך שעה אחת אם הם מבוצעים כראוי, וניתן להתחיל בהקלטות שעתיים עד שלוש שעות לאחר הזרקת הצבע. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לנטר בקפידה את מצבו הבריאותי של בעל החיים הניסיוני לאחר הפרוצדורה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון דימות פוטונים כפולים (two photon imaging), על מנת להקליט נוירונים במבני מוח עמוקים עוד יותר.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש לסמן ולהקליט תגובות של יחידות בודדות (single unit responses) מאוכלוסיית נוירונים מזוהה.