Solubilization ביו נטיה של נקודות קוונטיות ועל מבחני רעילות של חיידקים עקומת צמיחה הרוזן פלייט

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע סריקה ברזולוציה גבוהה (high throughput screening) של השפעות אנטי-בקטריאליות של ננו-חלקיקים, עם או ללא צימוד לאנטיביוטיקה. כאן, נבדקות ההשפעות האנטי-בקטריאליות של נקודות קוונטיות של קדמיום טלוריד המצומדות ל-poly mix ו-B כדי להשיג מטרה זו. הנקודות הקוונטיות מומסות תחילה ב-me, capto proprionic acid.

בשלב הבא, נקודות הקוונטום מצומדות ל-poly mix, ובתDWORDly, חיידקים שהועלו על מצע עם אנטיביוטיקה מטופלים הן בנקודות קוונטום מצומדות לאנטיביוטיקה והן בנקודות קוונטום שאינן מצומדות; מחצית מהדגימות נחשפות להקרנה של אור כחול באורך גל של 440 nanometer למשך 30 דקות, דבר הגורם לנקודות הקוונטום לייצר אקסיטון ומיני רדיו-חמצן רהאקטיביים, וזאת כדי להעריך את השפעת הטיפול בנקודות קוונטום על הצמיחה וההישרדות של החיידקים. נלקחות קריאות של צפיפות אופטית ומבוצעים ספירות של מושבות. הנתונים שהתקבלו מעידים כי יישום של נקודות קוונטום מסוג cadmium telluride המצומדות לאנטיביוטיקה, ולאחריו הקרנה, מניב את ההשפעות הקטלניות הגבוהות ביותר מבין התנאים שנבדקו.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ההשפעה של נקודות קוונטיות של קדמיום טלוריד והסמיכה שלהן ל-polyx in על גדילת E coli, ניתן להחיל אותה גם על סוגים אחרים של ננו-חלקיקים ואנטיביוטיקה על זני חיידקים שונים. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו, מכיוון שכל כמות עודפת של MPA תגרום להצטברות של הנקודות הקוונטיות, ואם ישאבו החוצה אפילו כמות קטנה של toline, הם יהרסו את המסנן.

אף על פי שהיום נדגים שיטה להערכת ההשפעות האנטיבקטריאליות של נקודות קוונטום מסוג KE IDE המשורששות לאנטיביוטיקה, ניתן להשתמש בשיטה דומה עם סוגים אחרים של נקודות קוונטום, כגון אינדיום פוספט, אבץ סולפט וקדמיום איודיד אבץ סולפט. התחילו את הפרוצדורה בהכנת תמיסה של נקודות קוונטום מסוג cadmium Telluride או CDTE בטולואן בריכוז 15 µM בתוך בקבוק זכוכית, מדדו את הצפיפות האופטית או ה-OD באמצעות ספקטרוסקופיית בליעה, והעבירו בעזרת פיפטה 200 µL מתמיסת המקור הזו לבקבוק זכוכית.

אין להשתמש בפלסטיק. לאחר מכן, הוסף 800 µL של toluene, 1 mL של borate buffer בריכוז 200 mM, ו-2 µL של MER capto proprionic acid או MPA בריכוז 11.5 M; סגור את הבקבוקון ונער אותו בעוצמה למשך 30 עד 60 שניות. לאחר הנעורה, השלב המימי והשלב האורגני יופרדו באופן ספונטני.

הפאזה המימית תאמץ את צבען של נקודות הקוואנטום. כדי להימנע משכבת הריצוף (tiling layer), הסירו אותה, ולאחר מכן הסירו את פאזת נקודות הקוואנטום והעבירו אותה למבחנה נקייה. כדי לטהר את נקודות הקוואנטום המומסות, העבירו אותן למסנן צנטריפוגה של 500 microliter.

הוסף 100 µL של בופר bore eight בריכוז 50 mM וסבב ב-3000 ×g למשך 13 דקות. בצע שטיפה זו ארבע פעמים. לאחר השטיפה האחרונה, השהה את הנקודות הקוונטיות השטופות ב-500 µL של בופר bore, ואחסן בטמפרטורה של 4 °C.

הם יהיו יציבים למשך שבוע עד שבועיים. כדי להעריך את ריכוז נקודות הקוונטום, מדד את ספקטרום הבליעה והפליטה. איור זה מציג נקודות קוונטום מסוג CDTE תחת תאורה של מנורת UV וספקטרום פליטה לפני ואחרי המסה במים, המראים שינוי מזניח בתכונות האופטיות כתוצאה מהחלפת הליגנד.

חלק זה של הפרוטוקול רלוונטי לכל ננו-חלקיק סולריזד במים בעל מטען שלילי, כולל נקודות קוונטיות מסחריות, חלקיקי מתכת ועוד. בדוגמה זו, האנטיביוטיקה poly mixen B או PMB תחובר לנקודות הקוונטיות ביחס מולרי של 30 ל-1. PMB הוא בעל מטען חיובי ומסתדר באופן עצמי ללא צורך בקומיגציה. ריאגנטים: המיס PMB במים.

בריכוז של 60 µM. עבור פלטת 96 בארות עם 0.3 mL חיידקים לבאר, בביצוע של ארבע חזרות (quad duplicates). 0.5 mL של קונזוגט בריכוז 200 nM מספיקים להכנת התמיסה, על ידי הוספת 100 µL של נקודות קוונטיות בריכוז 1 µM בבופר בורתים 50 mM לפרוטוקול במבחנת מיקרו-צנטריפוגה.

בשלב הבא, הוסף 50 µL של תמיסת האנטיביוטיקה PMB בריכוז 10 x או 60 µM במים למבחנת הצמידה (conjugate tube). הוסף 50 µL מים למבחנת הביקורת. השלם את הנפח ל-0.5 mL באמצעות בופר ate בריכוז 50 mM. הגן על המבחנות מאור באמצעות רדיד אלומיניום והצב אותן על רוטטור למשך שעה אחת.

במידה והתרחשה אגרגציה, חזרו על תהליך הצמידה (conjugation) עם ריכוזים נמוכים יותר של האנטיביוטיקה. בצעו טיטרציה של הריכוז כלפי מעלה עד שהחלקיקים לא יספגו באגרגציה, כדי לשטוף את התצמידים. שפכו את התמיסות דרך מסנן עם סף חיתוך של 10,000 למשקל מולקולרי, אשר יעיל עבור רוב סוגי האנטיביוטיקה אך לא עבור חלבונים או נוגדנים.

לבסוף, העריכו את מספר מולקולות האנטיביוטיקה לכל נקודה קוונטית באמצעות ספקטרוסקופיה של בליעה או פלואורסצנציה, ג'ל אלקטרופורזה או ספקטרוסקופיה של פוריאן באינפרה-אדום. איור זה מציג את ספקטרי הבליעה והפליטה הטיפוסיים של הנקודות הקוונטיות לפני צימוד של PMB, ואת הפליטה לאחר הוספה של 160 שוות מולריים של PMB.

כאן מוצג הקשר בין היחס של PMB לבין עוצמת הפליטה של נקודות הקוונטום (המסומנת בריבועים) ומיקום אורך גל השיא (המסומן במשולשים). ככל שריכוז ה-PMB עולה, עוצמת הפליטה של ה-QD יורדת, מה שמוביל להסטה באורך גל פליטת השיא. החלק הבא של הפרוטוקול מבוצע כדי לקבוע את ריכוז העיכוב החציוני, או IC 50, של האנטיביוטיקה ואת הרעילות הקוונטית, בערב שניים ימים לפני ניסוי הצמיד (conjugation).

זריעו 10 milliliters של מצע LB מקולוניה טרייה של e coli. למחרת, שעה עד שעתיים לפני הניסוי, מלאו כל אחד מהבארים של פלטת 96 בארים שקופה. עם מצע גידול, יש לסדר את פלטת הבדיקה כפי שמוצג כאן.

יש להעביר את הדגימות לפלטות בשלוש חזרות, וריכוזי האנטיביוטיקה צריכים להקיף טווח רחב מספיק כדי לכלול ריכוז אחד המעכב את החיידקים במידה מועטה מאוד וריכוז אחד ההורג את כולם. יש לכלול בשלוש חזרות גם את כל הבארי שמעבירים נקודות קוונטום בריכוזים שבהם ייעשה שימוש בניסויי הצמידות. באמצעות פיפט רב-ערוצי, מלאו את הבארי המתאימים ב-1 עד 50 µL של תרבית חיידקים.

הריכוז יהיה תלוי בקצב הגדילה של הזן הספציפי ויש לכייל אותו בהתאם. כדי לנטר את הגדילה, הנח את הפלטה בתוך קורא פלטות (plate reader) והגדר קריאה בכל 10 דקות למשך שעתיים באורך גל של 600 nanometers. כאשר כל התאים יגיעו ל-OD של 0.1 עד 0.15, הוצא את הפלטה מקורא הפלטות והפסק את ההקלטה.

בשלב הבא, הוסיפו את ה-PMB בנקודות קוונטיות לבארים המתאימות ובצעו חזרה של הניסוי בשלוש כפילויות, תוך כיסוי של מחצית מהפלטה בנייר אלומיניום. לאחר מכן, הניחו את הפלטה תחת מנורה מותאמת של 440 nanometer העשויה מ-LEDs של 2.4 milliwatt למשך 30 דקות כדי לחשוף את הצד המואר של הפלטה. לאחר החשיפה לאור, הכניסו את הפלטה לקורא הפלטות ורשמו את ה-OD 600 בכל 10 דקות למשך חמש עד 12 שעות, בהתאם לקצב הצמיחה. השתמשו בתוכנה כדי לשמור על טמפרטורה הנמוכה מ-32 °C במידת האפשר, על מנת למנוע התייבשות של התרביות.

שרטטו את עקומות הצמיחה בנקודת זמן נבחרת מול לוגריתם הריכוז וקבעו את ה-IC 50 של האנטיביוטיקה באמצעות משוואת היל המופיעה על המסך, כאשר H הוא מקדם היל. Y max היא נקודת הצמיחה הגבוהה ביותר ו-Y min היא נקודת אפס, רצוי שגם היא תהיה על מישור (plateau). בסוף תקופת ההקלטה, בארות שקופות יעידו על מוות תאי מלא, ומדרג של צפיפות תאים אמור להופיע לאורך ריכוזי התרופה העולים.

על החיידקים להראות עקומות גדילה בצורת S כפי שמוצג כאן. מיקומו של מישור הפלטו המקסימלי ישתנה מאוד בין זן לזן ותלוי גם בטמפרטורה. ניתן לבחור נקודת זמן נתונה כנציגה ולשרטט את הערכים מול log של האנטיביוטיקה כדי לקבל את ה-IC 50 להערכת נקודות קוונטום.

ניתן להפיק גרף של הישרדות מול הלוגריתם של ריכוז הנקודות הקוונטיות, אך השגת קטילה בקטריאלית משמעותית באמצעות נקודות קוונטיות בלבד בריכוזים המשמשים היא נדירה. לאחר שנקבעה הרעילות של הנקודות הקוונטיות והאנטיביוטיקה באופן נפרד, ניתן להחיל את אותו הפרוטוקול כדי לקבוע את הרעילות של האנטיביוטיקה. נקודות קוונטיות מצומדות מוצגות.

להלן דוגמה למערך הבדיקה. שימו לב כי הצמידים נבדקים בריכוזים עולים בשיטת כפילות ארבעית (quad duplicate); יש לכלול פס ביקורת של חיידקים בלבד, פס של תרופה בלבד ו בארות דגימה עבור נקודות קוונטום בלבד. ניתן להשתמש בקריאות OD 600 כדי להפיק עקומות גדילה, וערכי IC₅₀ כפי שנעשה בעבר.

איור זה מציג דוגמה של תסמיכים (conjugates) בעלי רעילות דומה לזו של האנטיביוטיקה לבדה, ודוגמה של תסמיכים בעלי רעילות גבוהה יותר. כדי לקבוע את מספר יחידות יוצרי המושבות (CFU) עבור כל תנאי, בחרו באחד או יותר מהבארים בלוח 96 הבארים המטופל לביצוע ספירת מושבות. בצעו דילול סדרתי של כל אחת מהדגימות החיידקיות שנבחרו באמצעות תמיסת מלח (saline solution).

לביצוע פעולה זו, העבירו בפיפט 180 µL של תמיסת מלח לעמודות המתאימות. העבירו 20 µL של תמיסת החיידקים ודללו עם 180 µL של תמיסת מלח. החליפו את טיפ הפיפט, ערבבו והעבירו 20 µL של תמיסת החיידקים המדוללת לתוך 180 µL של תמיסת מלח.

חזור על תהליך זה שש פעמים. לאחר מכן, קח 10 µL מכל אחת משש הדילוליות האחרונות והנח אותן כנקודות על פלטת Auger מלבנית. ניתן להניח 36 נקודות על פלטה מלבנית.

השאירו את הפלטה להתייבש במשך 15 דקות על המשטח. לאחר 15 דקות, דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך 16 שעות. בעקבות הדגירה, ספרו את המושבות כדי לקבוע את מספר היחידות יוצרות המושבות למילליליטר. הכפילו את מספר המושבות במקדם הדילול וחלקו בנפח שהועבר לפלטה כדי לקבוע את השפעת הטיפולים על הצמיחה הבקטריאלית.

צפיפות התאים של e coli נמדדה ב-OD 600. מוצגות כאן עקומות גדילה חיידקיות מייצגות עם ריכוזי תרופה שונים, מאפס ועד למות תאים מלאה. הסמלים הפתוחים מייצגים PMB בלבד עם الريכוזים המצוינים.

הסמלים המלאים הם C-D-T-E-P-M-B ללא הקרנה והסמלים החלקיים הם C-D-T-E-P-M-B עם הקרנה. להקרנה לא הייתה השפעה על דגימות של PMB בלבד, ולכן עקומים אלה הושמטו לצורך בהירות התצוגה. להלן גרפים של ערכי עקומת גדילה ב-200 דקות לעומת log PMB והתאמות למשוואה זו כדי לקבוע ערכי IC 50 לצורך בקרה על השפעות האור.

בוצע עקומות עם אנטיביוטיקה בלבד עם 30 דקות של חשיפה לאור. איור זה מראה הישרדות חיידקית ב-200 דקות לעומת ריכוז QD תוך שימוש ב-CDTE qds. נצפתה רעילות מסוימת עם חשיפה לאור, אך היא נמוכה מדי כדי לקבוע ערך IC 50.

דבר זה מעיד על כך שהרעילות של CDTE לבדו בריכוזים ששימשו בניסוי הצמידות היא זניחה לצורך השוואת ההשפעות של טיפולים שונים על צמיחת התאים. ערכי עקומת הצמיחה ב-200 דקות שורטטו והותאמו למשוואה שהוצגה קודם לכן, כפי שמוצג כאן. תצמידי C-D-T-E-P-M-B היו רעילים יותר מ-PMB לבדו. לשם השוואה, תצמידי ננו-חלקיקי זהב A-U-P-M-B אינם מראים עלייה ברעילות לעומת PMB לבדו, וזאת כדי לקבוע את השפעת הטיפולים על הישרדות החיידקים.

מספר יחידות יוצרות מושבות (CFU) נקבע עבור e coli שהוצבו בלוחית בעלת 96 בארות שטופלה ב-P-M-B-Q-D-P-M-B או ב-QD לבדו, עם או ללא הקרנת I למשך 30 דקות, ולאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 32 °C למשך ארבע שעות. דילולים סדרתיים של כל דגימה חיידקית בוצעו באמצעות תמיסת סלין, ו-10 µL של תמיסות בריכוזים של 100x עד 10⁷x נזרעו על צלחות אגר. הצלחות דגרו בטמפרטורה של 37 °C והמושבות נספרו לאחר 16 שעות.

בדוגמה זו, עמודות A עד C בלוחית הן חיידקים שטופלו בריכוזים עולים של CDTE. קונג'וגטים ללא הקרנה, ועמודות D עד F הן חיידקים שטופלו בריכוזים עולים של קונג'וגטים. לצד הקרנה של 30 דקות, הדילוציות מוצגות לאורך השורות.

הנתונים מעידים כי לאחר הקרנה, לתצמידים יש השפעה מעכבת חזקה יותר על צמיחת חיידקים בהשוואה לתצמידים ללא הקרנה. זכרו כי רכיבי ca רעילים ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות, חלוקי מעבדה ומשקפי מגן בעת ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן ביצוע סריקה בעלת תפוקה גבוהה (high throughput screening) של ההשפעה האנטי-בקטריאלית של ננו-חלקיקים עם או ללא צימוד לאנטיביוטיקה.