בזמן אמת הדמיה דיגיטלית של אינטראקציה ליקוציט-אנדותל של פגיעה איסכמיה reperfusion (IRI) של השריר Cremaster עכברוש

מיקרוסקופיה תוך-חיה (Intra vital microscopy) של המיקרו-סירקולציה של שריר ה-CRE היא שיטה נוחה להשגת תובנות לגבי איסכמיה ופגיעת רפירפוזיה ברקמת שריר משורר. בפרוטוקול שלב-אחרי-שלב, אנו מתארים כיצד להתחיל הרדמה תחת בקרה של נשימה עם ניטור מספיק באמצעות קנולציה עורקית, על מנת לשמור על בעל החיים במצב הרדמה יציב לפרקי זמן ממושכים. אנו מדגימים כיצד לבצע קנולציה לווריד הג'וגולרי (jugular vein) ולאחר מכן מתארים את הכנת רקמת ה-CRE כדף שטוח ודק להשגת רזולוציה אופטית גבוהה.

אנו מספקים פרוטוקול לדימות לוקוציטים בפגיעת פרפוזיה איסכמית אשר בוסס היטב במעבדותינו. מודל זה יכול לשמש לניתוח השפעת חמצון עבור מחקר על פגיעת איסכמיה וreperfusion.

פגיעת reperfusion לאחר איסכמיה מעורבת במגוון רחב של מצבים פתולוגיים, כגון אוטם בשריר הלב, איסכמיה של המעי, וכן לאחר השתלות וניתוחים קרדיווסקולריים. הפרפוזיה העודפת (Hyperperfusion) של רקמה שהייתה באיסכמיה, אף שהיא חיונית למניעת פגיעה בלתי הפיכה ברקמה, גורמת לדלקת מוגברת ברקמה הפגועה, לצד ייצור של מיני חמצן רהאיביים (reactive oxygen species), הפעלת מערכת המשלים ועלייה בתחלופיות המיקרווסקולרית. הפעלת לוקוציטים היא אחד הגורמים המרכזיים ברצף הפתולוגי של נזק דלקתי לרקמה במהלך ה-reperfusion.

אנו מקדמים כאן מיקרוסקופיה תוך-חיה (intra vital microscopy) של הווניולות הפוסט-קפילריות כשיטה נוחה לניתוח אקטיבציה של לוקוציטים בפגיעת איסכמיה-רפרפוזיה. בנוסף, אנו מדגימים טעויות נפוצות ומספקים טיפים שימושיים אשר יאפשרו לקורא להעריך באמת ולבצע את השיטה בבטחה. לאחר קבלת אישור מוועדת האתיקה, השתמשו בחולדות זכר בעלות משקל גוף של 120 עד 180 גרם, הניחו את החולדה בתוך קופסת פלקסיגלס והנשימו 2% עד 3% Isoflurin באמצעות מאייד Isoflurin.

ברגע שהושגה רמת ההרדמה המתאימה, שוקלים את החולדה ומגלחים את האזור הוונטרלי של הצוואר. מניחים את החולדה במצב שכיבה על הגב (dorsa recumbent) על משטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37 °C, ומספקים iso fluorine בריכוז של 2% נפח באמצעות מסכת סיליקון. את ההכנות הבאות מומלץ לבצע באמצעות מיקרוסקופ כירורגי.

בצע חתך עור אופקי באורך שני סנטימטרים באזור השקע הסטרנלי (stern notch) של ה-SRA. הפתק את בלוטות הרוק לצדדים. כעת השרירים הוונטרליים של הצוואר חשופים לפניך.

הפרידו אותם בזהירות בקו האמצע ואתרו את הקנה. חשפו סנטימטר אחד עד שניים של הקנה והניחו מיקרו-פינצטה מלמטה כדי להרים אותו. כעת, בערך במחצית הצד הגבני של הקנה, הכניסו צינור במידה של 14 gauges כצינור קנה אל החלק התחתון של הקנה, אשר חוברו מראש למנשם חיות.

לאחר מכן ניתן לשלוט בנשימה באמצעות בקרת נפח בתדר של 35 עד 45 נשימות לדקה. נפח נשימה של 4.5 עד 5 ml וריכוז isoflurane של 1.5 עד 2% נפח עבור הקניולציה של העורק התרדמי. את השריר הסטרנלי-היואידי (sternal hyoid muscle) הימני מפרידים באמצעות דיסקציה קהה.

כדי לאתר את העורק התהומי (carotid artery), הפר את עצב הוואגוס בזהירות מהעורק התהומי וקבע את העורק באמצעות פינצטת מיקרו של Anki כדי לעצור את זרימת הדם מהלב באמצעות שתי תפרים מתחת לעורק התהומי ביחס ללב; התפר הדיסטלי נקשר בחוזקה, בעוד שהתפר הפרוקסימלי נקשר באופן רפוי סביב העורק התהומי. יישום התפר הפרוקסימלי השני מונע דימום לאחר הסרת פינצטת המיקרו, כאשר ביצוע חתך קטן בעורק התהומי בין שתי הליגטורות נעשה באמצעות מספרי מיקרו. הכנס קטטר פוליאתילן מלא בתמיסת סליין נורמלית המחוברת למתמר לחץ (pressure transducer).

הסר את המיקרו-פינצטה והחדר את הקטטר עמוק יותר אל תוך העורק. בצע ניתוח תקופתי של גזים בדם עורקי באמצעות מכשיר לניתוח גזי דם, ושמור על pH של הדם בגבולות הפיזיולוגיים לצורך הגשה תוך-ורידית של צבעים פלורסצנטיים או תרופות אחרות הנחקרות. התמקד באזור הוריד הג'וגולרי השמאלי באמצעות המיקרוסקופ הכירורגי כאשר בידך פינצטה בכל צד, וקרע את הפסציה הדקה כדי לחשוף את הוריד הג'וגולרי.

קבעו את הווריד באמצעות מיקרו-פינצטה בזווית כדי לעצור את זרימת הדם. בעזרת פינצטה, העבירו שני קטעי תפר באורך שווה מתחת לווריד הג'וגולרי באופן זהה לקניולציה של העורק הקרוטידי, בצעו חתך קטן בווריד הג'וגולרי והחדירו קטטר פוליאתילן שנשטף עם תמיסת קווי התאים. השחילו את הקטטר לכיוון הלב והדקו את הרצועה הקרובה ביותר ללב.

מסביב לווריד ולקטטר, אנו משתמשים בבמה מאלומיניום לדמיון קרמסטרי (cremasteric imaging) שלב ארבעה המאמצת במהירות את הטמפרטורה הרצויה של פד החימום. החתך הראשוני מבוצע בעור ובפשיית הזרע החיצונית (external spermatic fascia) מעל השכין בקצה המרוחק ביותר, ולאחריו הרחבה זהירה של החלל התת-עורי באמצעות מספריים עדינים. ברגע שהרקמה נחשפת, היא נלחחת בתמיסת סליין שחוממה מראש.

רקמת חיבור בין הפסציה הספירמטית החיצונית לבין שריר ה-CRE master מוסרת בזהירות כדי לשחרר את שרירי ה-trimester מהרקמות הסובבות. סופרפוזיה רציפה במהלך הניתוח שומרת על הידרטציה של הרקמה, דבר המקל על הנראות וההסרה, כגון הקצה הדיסטלי של ה-CRE master S כדי להחזיק ולהאריך מעט את קצה ה-S בתוך הקצה הדיסטלי של השק בהיבט הוונטרלי ולהאריך את החתך באופן פרוקסימלי. באמצעות מיקרו-מספריים, כלי דם מדליפים מקוaterים בזהירות לאורך קווי החתך.

תוך שימוש ב-thermal Cory, שריר ה-open cray master מונח שטוח על בסיס האלומיניום, כאשר הוא עדיין מחובר על ידי רצועות דקות ל-EPIs שמתחת לאשך, כולל עורק ווריד קטנים. השתמש ב-ery כדי לאטום את כלי הדם ולחתוך את רצועות החיבור בין הרקמה הדיסקלית לרקמה הקרמסטרית. דחף בעדינות את האשך המבודד חזרה אל התעלה המפשעת.

בנוסף לקיבוע הראשון, המורכב מארבע תפרים של הרקמה וסרט דבק, פרסו בזהירות את רקמת השריר המקרב (cremasteric tissue) באופן רדיאלי על במה האלומיניום. מקמו שני קצוות של קטטר פוליאתילן קרוב לרקמת השריר המקרב לצורך מערך הסופרפוזיה (superfusion). שרטטו קו של ג'לי פטרוליום מסביב לשריר המקרב באמצעות מזרק כדי ליצור תא נוזלים.

הניחו כיסוי זכוכית מרובע מעל רקמת ה-cric והצמידו את הקצוות בחוזקה לקו הוואזלין. רקמת ה-cremasteric מוכנה כעת לדמיון מיקרוסקופי. ההגדרות הבסיסיות של ה-intra vital עשויות להשתנות.

אנו משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי-פלואורסצנטית (epi-fluorescence) למסלול חי (intra vital), המצויד במקור אור LED של 470 nanometer לצורך למינציה של EP. באמצעות עדשת שיקוע במים, אנו משיגים הגדלה של כ-800 x ותיעוד של התצפית באמצעות מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה. לצורך דימות פלואורסצנציה אפי-פלואורסצנטית, יש לבצע את הניסוי בחדר חשוך.

לסימון לוקוציטים, הזרק rumine six J בווריד דרך קטטר וג'וגולרי בריכוז של 0.4 milligram לקילוגרם ממשקל הגוף. בחר וריד פוסט-קפילרי לצורך תצפית. גודל כלי הדם צריך להיות בין 20 ל-60 micrometer וזרימת הדם צריכה להיות מספקת.

לפני התרחשות האיסכמיה, יש להמתין 30 דקות לייצוב הרקמה. לאחר מכן, בצעו הקלטה של 30 שניות כדי לקבוע ערכי בסיס עבור גלגול והיצמדות של לוקוציטים. הצמידו בעדינות תליב של כלי במר (bemer vessel clip) לקצה הפרוקסימלי ביותר של רקמת השריר הקרמסטרי (cremasteric tissue) החשופה, באמצעות פינצטת יישום.

הסר את תסמיך כלי הדם לאחר 30 דקות של איסכמיה. ניתן לבצע הקלטות נוספות לאורך תקופת הרפרפוזיה. לצורך כימות גלגול לוקוציטים, הגדר קו וירטואלי החוצה את כלי הדם באופן אנכי, שיהיה עקבי בכל ההקלטות.

ספרו ידנית את מספר הלוקוציטים המתגלגלים שעוברים את הקו בתוך 30 שניות. לצורך כימות של לוקוציטים דבקים, הגדירו קטע כלי דם של 200 מיקרומטר שיהיה עקבי בכל הרשומות.

ספרו את מספר הלויקוציטים הנראים בבירור שנותרים סטטיים במשך 30 שניות. תוצאות מייצגות מסופקות בתוך הפרוטוקול הכתוב. למרות שפגיעה מרפירפוזיה לאחר איסכמיה (Isch Reperfusion injury) קשורה למערכות איברים שונות, אנו מתארים כאן שיטה לניתוח אינטראקציה בין לויקוציטים לאנדותל בפגיעת רפירפוזיה ברקמת שריר שלם.

לפיכך, הדבר רלוונטי במיוחד לניתוחי השחלה (flip surgery), שכן ההנחה היא שפגיעה רקמתית פוסט-איסכמית באיברים אחרים כרוכה באותם מנגנוים דלקתיים. ניתן להשתמש בשיטה המתוארת כדי להשיג תובנות עקרוניות לגבי מנגנונים פתולוגיים בפגיעה כתוצאה מאיסכמיה וחיבור (ischemia fusion injury). ניתן לבצע בקלות הפעלת איסכמיה על שריר הקרמסטרה (cremaster muscle), אשר משקפת באופן מושלם תנאים קליניים רלוונטיים, כגון ניתוח מעבירה חופשית (free flap surgery).

יתרה מכך, ניתן להחיל בקלות שינויים כגון איסכמיה קרה או איסכמיה חמה, או סופרפוזיה כרומסטרית של חומרים המשפיעים על דלקת. הזרקה תוך-פיתית עשויה להיות שיטת הבחירה כאשר נדרש טיפול שעות או ימים לפני ההקלטה.