התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק ולאפיין תאי T לিমפוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (IPS cells). ניתן להבדיל את תאי ה-IPS in vitro במערכת תרבית של OP nine DL one ולאחר מכן להבשיל אותם in vivo בעכבר עם חסר ב-rag. לחלופין, ניתן להנדס את התאים גנטית כדי לבטא באופן יתר את OT one TCR ולאחר מכן להעבירם באופן אדופטיבי לצורך פיתוח in vivo.

לאחר שש שבועות של דיפרנציאציה in vivo, ניתן להעביד את העכברים על ידי הזרקה תוך-peritoneum של תאי גידול EEG seven, ולאחר מכן ניתן להעריך את הספציפיות לאנטיגן של תאי ה-T הגזורים מ-IPS. בסופו של דבר, תאי IPS יכולים להבדיל עצמם הן לתאי T קונבנציונליים והן לתאי T ספציפיים לאנטיגן, אשר האחרונים מסוגלים להגן על בעלי חיים מפני אתגר של גידול. ההשלכות של טכניקה זו נרחבות לעבר אימונותרפיה מותאמת אישית לסרטן.

השיטה מאפשרת הפקה של מספרים גדולים של תאי T מגיבים לגידולים, המופקים מכמות מינימלית של דם או רקמת עור של המטופל. ביום אפס, העבירו 5×10⁴ תאי IPS לצלוחית תרבית של 100 מילימטר המכילה שכבה אחת (monolayer) של תאי OP9-DL1 בצפיפות (confluent), במצע alpha-MEM עם 20% FBS. ביום החמישי, בצעו trypsinization. לאחר מכן, סנטריפוגו את התאים לאחר דגירה של 30 דקות בתוך צלוחית תרבית חדשה של 100 מילימטר באינקובטור בטמפרטורה של 37°C. פזרו 5×10⁵ מהתאים הצפים במצע alpha-MEM עם 20% FBS וליגנד mouse Flt3 על צלוחית חדשה של 100 מילימטר המכילה שכבה אחת של תאי OP9-DL1. ביום השמיני, שאבו בעדינות באמצעות פיפט את התאים שאינם קשורי היטב, סנטריפוגו אותם, ולאחר מכן העבירו את התאים לבאר אחת של פלטת תרבית עם 6 בארות המצופה בתאי OP9-DL1 בצפיפות. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ למשך שבועיים נוספים. ביום ה-22.

דגרו את תאי ה-IPS שהופרדו במצע טרי בצלחת תרבית חדשה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסירו כחצי מהתאים הצפים והעבירו אותם דרך מסננת ניילון של 70 micron כדי להוציא גושי תאים, ושטפו את תגלי התליה של התאים הבודדים שלוש פעמים ב-PBS קר. לאחר השטיפה השלישית, השעיו את התאים ב-PBS בריכוז של 1.5 times 10^7 תאים per milliliter ושמרו את התאים על קרח לפני הזרקה IV.

הנח עכבר עם חסר ב-rag בן ארבעה שבועות תחת תאורה באינפרא-אדום כדי להרחיב את וריד הזנב. לאחר מכן, מלא מזרק של 1 mL המצויד במחט במידה 26.5 ב-200 µL של תרחיף התאים והעבר את התאים באופן אדופטיבי דרך וריד הזנב המורחב. שלושה שבועות לאחר מכן, לאחר אישור ההמתה של העכבר שקיבל את ההעברה האדופטיבית, הסר את קשרי הלימפה ואת הטחול לאחר פירוק מכני של הרקמות.

בצעו ליזיס לתליית התאים הבודדים באמצעות בופר ליזיס CK, ולאחר מכן שטפו פעמיים את המונונוקלאריים שהתקבלו ב-PBS קר. לאחר צביעה של סמני שטח של התאים, העריכו את התאים באמצעות ניתוח פלוו-ציטומטרי ביום אפס. השתמשו ברכיב טרנספקציה של gene JAMA כדי לבצע טרנספקציה למשך לילה לתאי אריזה plat E בלוח, עם OT one MIDR. ביום הראשון, זרעו 1×10⁶ תאי iPS לתוך באער אחד של לוח 24 באערים שצופה מראש ב-0.1% ג'לטין. ביום השני, אספו את הפסאודו-וירוס המכיל S natin מתאי ה-plat E, ולאחר מכן העבירו אותו דרך מסנן של 0.4 מיקרון כדי להסיר מזהמים פוטנציאליים לאחר צנטריפוגה. בצעו טרנסדוקציה לתאים בנוכחות poly brain למשך שעה אחת ב-330×g ובטמפרטורה של 32°C.

דגרו אותם למשך הלילה באותה הטמפרטורה לאחר חזרה על הליך הטרנסדוקציה. ביום הרביעי, בצעו trypsinization לתאי ה-IPS שעברו טרנסדוקציה, ולאחר הפרדה של התאים למשקע (pelleting), השעיקו אותם מחדש במצע טרי וזרעו אותם על תאי מזין (feeder cells) מסוג snl 7 6 7 מקרינים ומקודדים מראש. לאחר שהתאים שעברו טרנסדוקציה הגיעו לקונפלואנסיות (confluency), בצעו מיון של התאים הכפולים החיוביים ל-GFP ו-DS red באמצעות ציטומטריית זרימה.

ששה שבועות לאחר ההעברה האימונית (adoptive transfer) של תאי ה-IPS, מזריקים 50 µL של תאי EEG seven thoma אל החלל הפריטוניאלי של אותה עכבר ביום ה-50 של אתגר הגידול. השתמש בערכת בידוד תאי T חיוביים ל-CD8 של mil E biotech כדי למיין תאי T חיוביים ל-CD8 מהטחול ומקשרי הלימפה של בעל החיים שעבר את ההעברה האימונית. ערבב את תאי ה-T החיוביים ל-CD8 המבודדים עם תאי SPOC size מקרינים מעכבר C 57 black six J נאיבי ביחס של 1:10, ובצע דחף (pulse) לתרבית המשותפת עם 0.5 µmol/mL של ova למשך 40 שעות.

לאחר מכן, הוסף felden A לתאים למשך ארבע שעות נוספות. לבסוף, הערך את אוכלוסיות התאים באמצעות אנליזה של ציטומטריה זרימה. לאחר בידוד תאי SP מעכבר C 57 black six J נאיבי, פצל את תרחיף התאים לשתי קבוצות.

סמנו את קבוצת ה-CFSE high באמצעות 5 µM של CFSE ודחפו את התאים עם 10 µg/ml של פפטיד ova למשך שעה אחת; סמנו את קבוצת ה-CFSE low באמצעות 0.5 µM של CFSE ואל תדחפו. ערבבו ב-PBS כ-2.5 × 10⁶ תאי CFSE high עם 2.5 × 10⁶ תאי CFSE low. לאחר מכן, נתחו את התאים באמצעות ציטומטריית זרימה (flow cytometry) לבדיקת ביטוי CFSE.

16 שעות לאחר העברה אדופטיבית לעכבר הנבדק. לספירת תאי גידול בתוךחלל הפריטונאום ביום ה-20 לאתגר הגידול. השתמש במזרק של 10 milliliter המצויד במחט בכי মাপ 18.5 וב-PBS קר לשטיפת חלל הפריטונאום. ספור את תאי הגידול שהופקו לצורך זיהוי תאים החודרים לגידול.

הסר את הגידול בשלב מאוחר של אתגר הגידול ולאחר מכן חתוך את הגידול לשלושה חלקים. העבר את חלק הגידול הראשון למבחנה לקירור (cryo vial) והנח את המבחנה על קרח יבש. קבע מיד את החלק השני בפורמאלדהיד.

שמור את החלק השלישי במצע RPMI 1640 מותנה לאחר ייבוש באוויר של נתחי הרקמה שנשמרו בהקפאה. קבע אותם באצטון קר למשך 15 דקות לאחר ייבוש נוסף באוויר של הנתחים המקובעים למשך 15 דקות. שטוף את השקופיות למשך חמש דקות ב-PBS לאחר השטיפה.

הניחו את השקופיות בתא לחות וכסו את חתכי הרקמה ב-30 µl של 3%B, SA ו-PBS למשך 30 דקות כדי לחסום קישור לא ספציפי. לאחר מכן, ספגו את תמיסת החסימה והדגירו את חתכי הרקמה עם תערובת של 50 µl של נוגדן pe anti TCR RV alpha two ונוגדן fitzy anti ova המדוללים ב-3%PSA ב-PBS בתא הלחות למשך שעתיים. בסיום הדגירה, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS קר, ולבסוף רכבו את החתכים באמצעות מדיום ריכוב על בסיס מים לפני בדיקה במיקרוסקופ פלואורסצנטי לצורך ניתוח ציטומטריה של זרימה של תאי T חודרים לגידול.

מעכו את הגידול לתליה של תאים בודדים. לאחר מכן, נתוחו את התאים לאיתור סממנים שטחיים ספציפיים. CD3 ו-TCR beta משמשים כסממנים לתאי T כדי לקבוע האם גרייה של תאי IPS באמצעות הליגנד notch DL1 עשויה לתרום להבעה שטחית של CD4 ו-CD8 על תאים המופקים מתאי IPS שהם CD3 חיוביים ו-TCR beta חיוביים.

שימו לב לתרשים הפיזור (dot plot) מצד ימין, המראה תאי T בעלי חיוביות בודדת ל-CD8 (single positive), שהם CD3 חיוביים, TCR $\beta$ חיוביים, CD4 שליליים ו-CD8 חיוביים, אשר נוצרו מתאי iPS in vitro. בנוסף, התאים בעלי החיוביות הבודדת שהופקו מתאי iPS מהאיור הקודם ייצרו interleukin 2 ו-interferon gamma כאשר עוררו in vitro באמצעות נוגדני anti-CD3 המצופים על פלטה ונוגדני anti-CD28 מסיסים, מה שמאשר כי תאי ה-T שהופקו מתאי iPS הם תפקודיים לאחר העברה אדופטיבית לעכברי מקלט. מרבית תאי ה-iPS שעברו טרנסדוקציה של גן TCR עברו דיפרנציאציה ל-CTLs חיוביים ל-CD8, אשר הגיבו in vitro לגירוי פפטידי על ידי הפרשת interleukin 2 ו-interferon gamma, כפי שמוצג בתרשימי הפיזור הללו מתאי קשרי לימפה וטחול מאוחדים.

תאי T חיוביים ל-CD eight ו-V beta five נוצרו בעכברים שקיבלו העברה אדופטיבית של תאי IPS שעברו טרנסדוקציית TCR, אך לא בתאי ביקורת שעברו טרנסדוקציה. האוכלוסיות החיוביות ל-CD eight ו-V beta five היו חיוביות לצביעה תוך-תאית של ציטוקינים עבור ייצור של interleukin two ו-interferon gamma, המיוצגים בהיסטוגרמות אלו על ידי הקווים הכהים בהשוואה להיסטוגרמות של ביקורת האיזוטייפ המוצללות, מה שמעיד על כך שתאי ה-CTL שנגזרו מתאי ה-IPS היו פונקציונליים. נתונים אלו מראים תאי CFSE high שקיבלו פולס של eptide, המיוצגים על ידי הפסגות מימין בכל גרף, ותאי ביקורת CFSE low המיוצגים על ידי הפסגות משמאל, אשר הוזריקו לעכברים 10 שבועות לאחר העברת תאי ה-IPS או יום אחד לאחר העברת תאי O OT one CTL.

תאי ה-CTL שהופקו מ-IPS ספציפיים לאנטיגן הגיבו לגירוי של אנטיגן והפגינו פעילות ציטוטוקסית, כפי שמעיד היעדר תאים בעלי ביטוי גבוה של CFSE כאן. תאי IPS שעברו טרנסדוקציה של גן TCR של OT one הועברו באופן אדופטיבי לעכברי C 57 black six, ולאחר מכן העכברים הוכפפו לאתגר באמצעות תאי גידול EEG seven. ביום 20 נספרו תאי הגידול בחלל הפריטונאום. שימו לב להפסית המשמעותית במספר תאי הגידול בעכברים שקיבלו IPS שעברו TCR TRANSDUCED בהשוואה לקבוצות הביקורת.

החשוב מכל, העברה אדופטיבית של תאי IPS שעברו טרנסדוקציית TCR עוררה חדירה של תאי CTL תגובתיים-יתר לרקמות הגידול והגנה על בעלי החיים מפני אתגר גידול, כפי שניתן לראות בצביעת H&E זו של רקמות גידול שהופקו ביום 30 עד 35 לאחר אתגר הגידול; גידולים מעכברים שקיבלו העברה אדופטיבית של תאים שעברו טרנסדוקציית TCR או תאי OT-I CTL, אך לא אלו שקיבלו הזרקה של mock או ביקורת. תאים שעברו טרנסדוקציה הוחדרו על ידי תאים דלקתיים, כפי שמסומן על ידי החיצים האדומים כאן. תאי CTL חיוביים ל-Vα2 ספציפיים ל-Ova, בצבע אדום, נמצאו כחודרים לרקמות גידול המבטאות Ova, בצבע ירוק.

בעוד שבגידולים של עכברים מקבוצות הביקורת בתבנית זו נצפו פחות תאים חודרים לגידול או שלא נצפו כלל, תרחיפי תאים בודדים מרקמות גידול נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה לבדיקת ביטוי של חיוביות ל-V alpha two וחיוביות ל-V beta five, לאחר ביצוע gating על האוכלוסייה החיובית ל-CD eight. שימו לב שרקמות גידול מעכברים שקיבלו תאי IPS שעברו טרנסדוקציה של TCR בשיטה אדופטיבית הראו את הרמה הגבוהה ביותר של תאים חודרים לגידול, בעוד שגידולים מעכברים שקיבלו תאי IPS שעברו טרנסדוקציה של ביקורת לא הראו חדירה של תאי T חיוביים ל-CD eight הספציפיים ל-ova.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים תאי T ספציפיים לאנטיגן מתאי IPS, וכיצד להעריך את תפקודם של תאי T שהופקו מתאי IPS.