הדמיה וניתוח של זרימת הדם ואת צריכת החמצן microcirculation כבד: בקשה דגם הפטיטיס חריפה

מערכת אופטית פותחה להדמיה של המיקרוסירקולציה הכבדית באמצעות אריתרוציטים מסומנים פלואורסצנטית, ולמדידת הלחץ הפרציאלי של חמצן בכלי הדם המיקרוסקופיים באמצעות דימויי פוספו-לייזר (laser assisted phospho imagery). שיטה זו יכולה לשמש לחקר מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים על ידי ניתוח מבנה המיקרווסקולריה, קוטר כלי הדם, מהירות זרימת הדם ומתח החמצן. במיקרוסירקולציה הכבדית, הדם זורם מסינוסואידים פורטליים (portal ES) לסינוסואידים מרכזיים (central Es), ובכך נוצר מדרג חמצן בין השניים.

ריכוז החמצן בכבד משפיע הן על ביטוי אנזימים והן על פתולוגיה, מה שהופך את ניתוח זרימת הדם ומדידת החמצן לנושאים חשובים במחקר. השיטה הניסויית שלנו כוללת הזרקה תוך-ורידית של תאי דם אדומים המסומנים בفلואורסצנציה.

על מנת להדמיות של מיקרוסירקולציה באמצעות פלואורסצנציה למדידת לחץ חלקי של חמצן, אנו מחדירים לווריד פלדיום פורפירין, הפולט פוספורסצנציה בזרם הדם כאשר הוא מעורר על ידי לייזר במידה התלויה בריכוז החמצן שמסביב. תהליך זה מאפשר ניתוח כמותי של חמצן; מדידת לחץ חלקי של חמצן במיקרוסירקולציה הכבדית הראתה לחץ חלקי של חמצן בווריד השער ובווריד המרכזי של 59.8 ו-38.9 millimeters of mercury בהתאמה, מה שמעיד על מדידה יעילה של ריכוז החמצן. לאחר מכן, יישמנו מתודולוגיה זו במודל של דלקת כבד.

מצאנו לחץ חלקי מוגבר של חמצן בסינוסואידים ובוורידי המרכז (central veins) של השער, אך הפרש לחצים מופחת בין ורידי השער לוורידי המרכז. הדבר נובע ככל הנראה מירידה בצריכת החמצן באזור ורידי המרכז עקב נמק של תאי כבד (hepatocyte necrosis). תוצאות אלו מראות כי המתודולוגיה שלנו, המשתמשת במערכת אופטית למדידת המודינמיקה הכבדית וצריכת החמצן, מסוגלת להבהיר מנגנונים של מחלות כבד שונות במחזור הדם המיקרווסקולרי של הכבד.

מפלס החמצן הוא פרמטר חיוני המשפיע על ביטויי אנזימים באזורים הפריפורטליים והפארה-מרכזיים, וכן על סוגים של מחלות כבד הקשורות להתפסויות מיקרוסקופיות, ולכן חשוב לכמת את זרימת הדם ואת צריכת החמצן. כדי להבהיר את המנגנונים, היתרון של השיטה שלנו הוא שמדידה אופטית רציפה וללא מגע מאפשרת לכמת את זרימת הדם, קטרי כלי דם והמפלס של החמצן במחזור הדם המיקרוסקופי של הכבד. דם מלא נשאב מעכבר תורם, והאריתרוציטים נשטפו פעמיים ב-PBS באמצעות סבב צנטריפוגה ב-400 G למשך חמש דקות.

בשלב הבא, המסו 2 mg של FITC ב-1 mL של 100 mM של sodium hydrogen phosphate מזוקק, לפני הסינון דרך ממבנה עם נקביות של 0.2 micron. לאחר מכן, העבירו למבחנה 1 mL של תמיסת FITC יחד עם 0.15 mL של תמיסת דקסטראן בריכוז 3 mM, 0.25 mL של 180 mM של sodium hydrogen phosphate מזוקק, ו-1.5 mL של 100 mM של sodium hydrogen phosphate מזוקק, והקישו על המבחנה לערבוב. השאירו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, לפני שטיפת תאי ה-RBC הצבועים פעמיים ב-PBS.

בשלב הבא, הניחו כמות קטנה של תרחיף RBC על עלית זכוכית ואששו הן את המראה התקין של ה-RBC והן פלואורסצנציה מספקת. השעו 0.1 milliliter של RBCs ב-0.9 milliliter של PBS ושמרו בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius עד לשימוש. לאחר מכן, המיסו 500 milligrams של BSA ב-10 milliliters של PBS. לאחר מכן הוסיפו 30 milligrams של פלדיום פורפירין וערבבו לסירוגין במהלך הלילה. סנטריפיגו את התמיסה כדי להסיר פלדיום פורפירין שלא הומס, וסננו את הסופרנאטנט דרך ממברנת פילטר של 0.2 micron. העבירו own milliliter של התסנן למבחנות אחסון ושמרו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות Celsius. הקפידו להימנע מהקפאה והפשרה חוזרות.

כדי להדגים את המיקרוסירקולציה במיקרוסקופ, קרבו חור בקוטר 20 millimeter בלוח פלסטיק וכסו את החור בזכוכית כיסוי ריבועית בעלת צלע של 30 millimeter. לאחר קנולציה של וריד הזנב, פרסו את האונה הכבדית הראשית על לוח פלסטיק במצב שכיבה על הבטן. לאחר מכן, השתמשו במספר חתיכות של ניילון נשמר בגודל 3 millimeter על 8 millimeter כדי לכסות את האזור שסביב האונה, זאת למניעת תזוזה כתוצאה מנשימה ומניעת התייבשות.

הדמיאו את הסירקולציה הכבדית באמצעות מיקרוסקופ העברה ואשרו כי אין סטזיס של זרימת הדם בשדה הראייה למשך 15 דקות לפחות. כדי לצפות בזרימת הדם, מזריקו בהדרגה 0.2 מיליליטר של RBCs מסומני פלואורסצנציה.

כדי למדוד את הלחץ החלקי של החמצן, יש להזריק 0.2 milliliters של תמיסת פלדיום פורפירין. תאי RBCs המסומנים ב-FITC יהוו מכנה משותף של 1/50 מכל ה-RBCs במחזור הדם באזור המדומיין; עוררו את ה-FITC על ידי הקרנה של מנורת כספית העוברת דרך מסנן Band pass של 450 עד 490 nanometer, והקליטו את הפלואורסצנציה באמצעות מצלמת CCD. הפוספורסצנציה של פלדיום פורפירין חלשה יחסית ודורשת גלאי בעל רגישות גבוהה וחדר חשוך.

שיאי הבליעה של פורפירין פלדיום הם סביב 410 ו-532 ננומטר, ומומלץ להשתמש באורך גל של הרמוני שני של 532 ננומטר. אורך גל זה מופק על ידי לייזר פולסים מסוג neodymium YAG; חברו את קרן הלייזר למיקרוסקופ הפוך וכוונו אותה כך שהקרן תאיר את מרכז מישור המוקד. הרזולוציה המרחבית של הלייזר תלויה בגודל נקודת המיקוד, שניתן לכוונן על ידי העברת הקרן דרך חור סיכה (pinhole).

חבר למסיר גם מסנן מעביר אורך גל ארוך (long pass filter) ושפופרת מכפיל פוטונים (PMT) לצורך גילוי פוספורסנציה. ה-PMT צריך להיות רגיש לאורכי גל אדומים, במיוחד סביב 700 nanometers. דגום את אות הפוספורסנציה וחשב את קבוע זמן הדעיכה באמצעות פונקציה מעריכית.

בניסוי זה, דגמנו 500 נקודות בתדר של 200 kilohertz. לצורך כיול, הכינו שני תמיסות פלדיום פורפירין עם לחץ חלקי של חמצן של 150 ואפס מילימטרים של כספית כל אחת. עבור התמיסה של אפס מילימטרים של כספית, הוסיפו 1%dihi sodium לדגימות כדי ליצור תנאי של היעדר חמצן במהלך הכיול.

שמור על pH של 7.4 וטמפרטורה של 37 °C בדגימה. מקם את העכבר על בסיס המיקרוסקופ וכוון את כלי הדם המיקרוסקופיים שברצונך להדגים בהם את המיקרו-סירקולציה הכבדית אל נקודת קרן הלייזר. השאר עכברים עם גישה חופשית למים למשך לילה, והזרק acetaminophen במינון של 200 mg/kg באופן אינטraperitoneal. 24 שעות לאחר ההזרקה, הרדם את העכבר וחשוף את הכבד באמצעות חתך חציוני. במקרה של דלקת כבד (hepatitis), היא תהיה נראית בבירור לעין בלתי מזוינת דרך נמק (necrosis) באזור הפארה-מרכזי.

המדידות שלנו של לחץ חלקי של חמצן ובמיקרו-כלי דם כבדיים בעכברים הראו לחצי חמצן ממוצעים עבור ורידי השער, הסינוסואידים והורידים המרכזיים של 59.8, 48.2 ו-38.9 מילימטרים של כספית, בהתאמה. במילים אחרות, מפל החמצן מהוריד השער אל הווריד המרכזי מעיד על שחרור מספיק של חמצן מתאי דם אדומים בעת מעברם דרך הסינוסואידים. הכנו עכברים עם דלקת כבד שרוגזה על ידי אצטמינופן כדי למדוד מיקרו-כלי דם כבדיים.

כמודל פתולוגי לדוגמה, מצאנו כי הלחצים הפרציאליים של חמצן בוורידים השערתיים, בסינוסואידים ובורידים המרכזיים היו גבוהים יותר בקבוצת האצטמינופן בהשוואה לעכברים רגילים. הפרש הלחץ הפרציאלי של חמצן בין הוורידים השערתיים למרכזיים היה 20.9 millimeters of mercury עבור עכברים רגילים ו-16.9 millimeters of mercury עבור עכברים במודל של דלקת כבד. הפרש הלחץ הפרציאלי של חמצן בין הוורידים השערתיים למרכזיים היה 20.9 millimeters of mercury עבור עכברים רגילים ו-16.9 millimeters of mercury עבור עכברים במודל של דלקת כבד.

מפל החמסן במיקרו-סירקולציה הכבדית נובע בעיקר מאספקת החמסן מהוריד השער, אשר נצרכת על ידי ההפטוציטים. נמק של הפטוציטים באזור הוורידי המרכזי הנגרם על ידי אצטמינופן מוביל לירידה בצריכת החמסן, במיקרו-סירקולציה במורד הזרם, ולפיכך לבעיות הקשורות להמודינמיקה. אספקת חמסן וצריכת חמסן מעורבות בצורות רבות של מחלות כבד. יצרנו מודל של דלקת כבד חריפה ומצאנו עלייה בלחץ החמסן בכלי דם זעירים.

ניתן להשתמש במערכת האופטית שלנו כדי לחקור מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים באמצעות ניתוח של מבנה המיקרווסקולרי, חלוקת הזרימה וצריכת החמצן.