Immobilization Planarian, הקרנה חלקית, השתלת רקמות
6 באוגוסט 2012
השיטה יעילה השתלת רקמות בגודל מוגדרת ועקבית בין planaria מתואר. היא כללה גם תיאור של איך להשתמש בטכניקה immobilization להשתלה ניתן להתאים, בשיתוף עם מגן עופרת, הקרנה חלקית של בעלי חיים.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למקם אוכלוסייה של תאי גזע בריאים בסמיכות לרקמה שבה הושמדו תאי גזע בתוך פאריאן (parian), וזאת כדי לנתח את התנהגות תאי הגזע והצאצאים שלהם in vivo במהלך התחדשות. מטרה זו מושגת על ידי הרדמה וקיבוע של פאריאן שלא הוקרן או של פאריאן שעבר הקרנת Leafly לצורך מניפולציות נוספות. לאחר מכן, הפאריאן המקובע שלא הוקרן ממוגן חלקית בעופרת ולאחר מכן עובר הקרנת x-ray, פעולה היוצרת פאריאן ללא פגיעה, שבו רקמה עם תאי גזע מושמדים נמצאת בסמיכות לרקמה המוגנת שנותרה עשירה בתאי גזע.
לחלופין, ניתן להשתיל רקמה נלקחת מתורם שלא הוקרן אל תוך מאחסן שהוקרן בעבר, וזאת כדי ליצור פרט עם אוכלוסייה מבודדת של תאי גזע. תוצאות המאחסן שבו הושמדו תאי הגזע מראות אוכלוסיות מבודדות של תאי גזע הסמוכות לרקמות שבהן הושמדו תאי הגזע, כפי שעולה מהיברידיזציה של RNA in situ עבור גנים המסמנים תאי גזע בשיטת whole mount.
השיטות המתוארות כאן שואפות להבין טוב יותר את תהליך הרגנרציה בפלנריות על ידי חקר התנהגות תאי גזע הן במודל של השתלה והן במודל של הקרנה חלקית, המאפשרים לבחון האם הרקמות הסובבות והסביבות המקומיות שבהן שוהים תאי גזע אלו משפיעות על התנהגות הניובלסטים או תאי הגזע. במהלך תהליך הרגנרציה, חודש עד חודשיים לפני הניסוי, יש להאכיל את הפלנריות בהתאם לכתב היד המצורף. כדי להשיג את הגודל הרצוי בהדגמה זו, נבחרות פלנריות באורך של 1 עד 2 ס"מ וברוחב הגדול מ-2 מ"מ.
לאחר מכן, הם מורעבים שלושה עד שבעה ימים לפני השימוש. בשלב הבא, הכינו את תמיסת ה-Chlorotone, אלחוש מקומי קל, על ידי המסת 0.1 עד 0.2% משקל לנפח של cleone במים מזוקקים. לאחר מכן, קררו את התמיסה על קרח לצורך השתלת הרקמה. בעזרת מבער בונסן, כופפו צינור קפילרי בעל קוטר פנימי של 0.75 millimeter במרחק של אחד עד שני סנטימטרים מהקצה בזווית של 90 מעלות, לצורך חיתוך רקמת השתל.
לאחר מכן, כופפו צינור קפילרי נוסף בעל קוטר חיצוני של 0.7 millimeter בזווית של 90 מעלות, במרחק של one to two centimeters מהקצה, כדי ליצור חור במארח לקליטת השתל. לאחר מכן, גזרו את נייר המסנן השחור watman מספר 3, נייר מסנן Kim wipe ונייר סיגריות בהתאם לגדלים המצוינים בכתב היד המצורף.
לאחר מכן, הכין את תמיסת Holt Fers המ модиפית ואת תמיסת Holt Fretter הרוויה של Caine. קורר את שתיהן ל-4 °C. לאחר מכן, הצמד נייר ניגוב מסוג Kim מקופל לריבוע של Paraform.
הנח זאת על פלטת קירור פלטייר (Peltier) או על התקן קירור אחר תחת מיקרוסקופ סטריאו. לאחר מכן, השרה את נייר ה-Kim בתוספת של תמיסת Holt Fretter מקוררת. לאחר מכן, הנח שני מלבני נייר מסנן שחור על נייר ה-Kim.
כעת הניחו פיסת נייר סינון Watman מספר 2 בתוך צלחת פטרי. הרטיבו את נייר הסינון בתמיסת Holt Fretter. לאחר מכן, קררו את הצלחת על קרח לצורך הקרה חלקית.
הניחו נייר סינון גדול יותר בתוך צלחת גדולה יותר, באופן דומה להשתלת רקמה. הרטיבו את נייר הסינון בתמיסת Holt Fretter. לאחר מכן, קררו את הצלחת על קרח.
בנוהל זה, מלאו צלחת פטרי בתמיסת cleone מקוררת. העבירו בעזרת פיפט את הפלנריה לצלחת לצורך השתלה. הרדימו רק מאחסן אחד ותורם אחד בכל פעם.
עבור הקרנה חלקית, ניתן להרדימם של בעלי חיים רבים בו-זמנית. לאחר מכן, יש להשרות את ה-paria בתמיסת cleone למשך חמש עד 10 דקות עד שיהפכו לחסרי תנועה. יש לשטוף את ה-paria על ידי העברתם באמצעות פיפט למאג'ית המלא בתמיסת Holt Fretter מקוררת.
לאחר מכן, קבע את אזור ה-plin על ידי העברתו בעזרת פיפטה למסנני נייר שחורים הרווים בתמיסת Holt fretter מקוררת. לאחר מכן, הפו אותם בעזרת פינצטה כך שהצד הגחוני (ventral side) פונה כלפי מטה. כעת, מקמו צלחת פטרי מקוררת שהוכנה קודם לכן בתוך דלי קרח, כך שתתאים להכנסה למקרין רנטגן מסוג top source.
סדרו את אזור הפלן (plin) המורדם בתוך צלחת פטרי על ידי הזזת ניירות המסנן השחורים. לאחר מכן, העבירו אותם למקרין רנטגן (X-ray) מקור עליון ומקמו את דלי הקרח כך שהמרחק מצינור הקתודה לפריה (paria) יהיה מינימלי. בכך תמקסמו את קצב המינון האפקטיבי.
לאחר מכן, מקמו את מגיני העופרת בין ה-paria לבין שפופרת הקתודה עבור מינון קרני ה-x. אם נדרשת אבלציה מלאה של תאי גזע מאזורים שאינם מוגנים, הגישו מינון של 30 grays או יותר. מיד לאחר פליטת קרני ה-x, העבירו את ה-parian למים קרים של parian.
לאחר מכן, יש לאפשר למי הפריאן להתחמם לטמפרטורת החדר ולבעלי החיים להשתחרר בעצמם מנייר המסנן השחור. הליך ההקרנה החלקית הושלם כעת. כדי להתחיל בהליך זה תחת מיקרוסקופ הסטריאו, סדרו את אזורי המאכסן והתורם המורדמים על מסננים שחורים מלבניים נפרדים על גבי נייר ניגוב מסוג Kim wipe, שכבר קורר על פלטת פלטייר או פלטת קירור.
השתמשו בצינור קפילרי בעל קוטר פנימי של 0.75 millimeter כדי לחתוך את נגעי השתל מהתורם. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להניח אותו בחלק שאינו בשימוש של המארח. לאחר מכן, השתמשו בצינור קפילרי בעל קוטר חיצוני של 0.7 millimeter כדי להוציא נגעי רקמה מהמארח.
לאחר מכן, מקם את הש Transplant בתוך החור. העבר את המאחס המשתול מנייר המסנן השחור והמלבני לצלחת הפטרי שהוכנה קודם לכן. הרטב פיסת נייר גלגול בתמיסת Holt Fretter רוויה ב-Caine.
לאחר מכן, הנח זאת מעל המאחס המועבר. בשלב הבא, השגב ארבעה חתיכות של נייר סינון הספוג בתמיסת Holter רוויה, ובמקרה שהמאחס המועבר שוקע, השגב לאחר מכן ארבעה גושי נייר Kim wipe גזור הספוגים בתמיסת Holt Fretter רוויה. הנח אותם מעל ניירות הסינון.
לאחר מכן, סגור את המכסה. הנח את צלחת הפטרי על קרח. לאחר מכן, העבר את ה-donor parian אל מי ה-parian לצורך התאוששות וההתחדשות.
עם השלמת כל ההשתלות, יש להניח את ה-parian המשתול במדגרה בטמפרטורה של 10 °C למשך לילה. למחרת בבוקר, העבירו אותו לצחנת פטרי המלאה במי parian. אפשרו ל-parian להשתחרר בעצמו מנייר הסינון או הסירו אותו בעדינות בעזרת פינצטה, והחליפו את מי ה-parian פעם אחת בכל יומיים עד שלושה ימים לאחר מכן.
היברידיזציה עין-סיטו (in situ hybridization) על הרכבה של חור ב-parian שהוקרן, אך שימש כביקורת מוגנת לחלוטין וקובע שלושה ימים לאחר ההקרנה, מראה התפלגות תאי גזע שאינה ניתנת להבחנה מזו של parian מסוג בר (wild type). מנגד, עבור ה-parian שהיה מוגן באופן חלקי בלבד, כך שחלקיו הקדמיים והאחוריים נותרו חשופים, נראה כי תאי הגזע נמחקו מהאזורים שלא היו מוגנים. כאן מוצגים המבטים הגבי והבטני של parian שעבר השתלה מוצלחת.
שלושה ימים לאחר ההשתלה, הש transplanted נראה בבירור הן במשטח הגבי (dorsal) והן במשטח הבטני (ventral), והוא מוקף ברקמה לא פיגמנטית אופיינית בממשק שבין הש transplanted למארח. עם זאת, בהשתלה שאינה מוצלחת לא נראית רקמת transplanted גלויה באתר ההשתלה. היברידיזציה במקום (in situ hybridization) של דגימה שלמה (whole mount) חשפה נוכחות של תאי גזע רק בתוך או סביב מיקום הש transplanted, דבר המעיד על הצלחת ההשתלה לאחר רכישת המיומנות.
ניתן לבצע השתלות תוך חמש דקות לכל אחת. כאשר שיעורי ההצלחה שואפים ל-90 עד 100%, ניתן להגדיל משמעותית את היקף ההקרנה החלקית, בהנחה שגודל השטח של המקרן שלכם גדול מספיק.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה להשתלה של רקמה בגודל מוגדר בין פלנריה, תוך שימוש בטכניקת קיבוע לצורך השתלה. השיטה מאפשרת גם הקרנה חלקית של בעלי חיים חיים באמצעות מגיני עופרת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה רגנרטיבית
- מחקר תאי גזע
רקע
- הבנת התנהגות תאי הגזע במהלך התחדשות היא קריטית.
- פלנריה משמשת כאורגניזם מודל לחקר התחדשות.
- שיטות קודמות חסרו דיוק בהשתכלת רקמות.
- טכניקות של הקרה חלקית יכולות להשפיע על הדינמיקה של תאי הגזע.
מטרת המחקר
- לניתוח התנהגות תאי גזע וצאצאיהם in vivo במהלך התחדשות.
- לפיתוח שיטה מהימנה להשתתת רקמה בפלנריה.
- לבחינת השפעות ההקרנה על אוכלוסיות תאי גזע.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרדמה וקיבוע של פלנריות לצורך מניפולציה.
- שימוש במגני עופרת להקרנה חלקית של רקמות.
- השתלת רקמות מתורמים שלא הוקרנו למארחים שהוקרנו.
- ביצוע היברידיזציה של RNA in situ בשיטת whole mount לצורך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- השתלה מוצלחת של רקמות בגדלים מוגדרים בין פלנריות.
- בידוד של אוכלוסיות תאי גזע הסמוכות לרקמות שהוסרו.
- הדגמה של השפעות ההקרנה על התנהגות תאי גזע.
- מתן תובנות לגבי דינמיקת תאי גזע במהלך התחדשות.
מסקנות
- השיטה שפותחה משפרת את הדיוק בהשתלת רקמות.
- ניתן להשתמש ביעירה חלקית באופן יעיל כדי לחקור אינטראקציות של תאי גזע.
- הממצאים תורמים להבנת תהליכי רגנרציה בפלנריה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקרנה חלקית של פלנריה והשתתלת רקמות מאפשרות חקירה מדויקת in vivo של התנהגויות תאי גזע בוגרים, ובכך תומכות בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי גילוי מוקדמים. שיטות אלו מקלות על בידודם ובדיקתם התפקודית של תתי-אוכלוסיות של תאי גזע, ובכך מספקות מידע ישיר לתיקוף מטרות ולניתוח מסלולים רגנרטיביים. אימוץ נרחב של פרוטוקולים ניתנים להרחבה אלה מגביר את הביטחון החזוי בנקודות מפנה מרכזיות בפורטפוליו של מו"פ בתחומי הרפואה הרגנרטיבית ותאי הגזע.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ניתוח תפקודי של ההטרוגניות של תאי גזע ושל יכולת ההתחדשות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד גורמים אוטונומיים לתא וגורמים שאינם אוטונומיים.
- מקל על תיקוף של מטרות רגנרטיביות מונחה-השערות במערכת in vivo ניתנת לניהול.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק הכנה הניתנת לשחזור של מודלים של פלנריה עבור בדיקות תפקודיות המשך.
- מסטנדרטיז את זרימות העבודה של הקרנה חלקית והשתלה לצורך קריאות כמותיות.
- מאפשר יצירה בקנה מידה רחב של בעלי חיים עבור מחקרי אוכלוסין מחדש או אבלציה בעדויות רבות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי אפשור מעקב in vivo אחר גורלם של תאי גזע.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מנגנונים רגנרטיביים.
- מפחית עמימות ביולוגית במודלים של תיקון רקמות המונע על ידי תאי גזע.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקולים אלו ממיצעים את מודלי הפלנריה כגשר השוער, החל משלב הגילוי המוקדם ועד לזיהוי מועמדים (leads) במסלולי מחקר בתחומי הרגנרציה ותאי הגזע.
- ביולוגיה של הגילוי: מבודד וחוקר תתי-אוכלוסיות של תאי גזע כדי להבהיר מסלולים רגנרטיביים.
- סריקה: מספק מודלים סטנדרטיים הניתנים לשחזור להערכה כמותית של תפקוד תאי גזע.
- אנליטיקה: מאפשר ביצוע whole-mount in situ hybridization לניתוח של סמני תאי גזע ברזולוציה מרחבית.
- מחקר תרגומי: מספק פלטפורמה להערכת השפעות תאיות-אוטונומיות וסביבתיות על רגנרציה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פרוטוקולים ניתנים להרחבה בעלי יעילות גבוהה לשימוש חוזר בתוכניות של ביולוגיה רגנרטיבית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות של תאי גזע ובמחקרים של מנגנונים רגנרטיביים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות, את היכולת להרחבה (scalability) ואת התפוקה של בדיקות תפקודיות in vivo.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות חלטיות של go/no-go על ידי הפחתת אי-ודאות מנגנונית בתוכניות בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לטיפולים רגנרטיביים ובמבוססי תאי גזע.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בפלנריות, קיבוע וטכניקות של מיקרו-דיסקציה.
- נחוש גישה לציוד להקרנה בקרני X ולמיגון עופרת עבור אבלציה חלקית.
- דורש פרוטוקולים סטנדרטיים כדי להבטיח הדירות בין צוותים ויכולת השוואה של נתונים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה ותיקוף של הפרוטוקול.
- התפוקה מוגבלת על ידי שלבים ידניים, אם כי הפרוטוקולים עברו אופטימיזציה ליעילות ולקנה מידה.
