ב electroporation לג'ימי של המוח התיכון צ'יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין
3 באוגוסט 2012
כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה המערבת ב לג'ימי Electroporation של מבנים DNA פלסמיד לתוך עובריים הגחון חומוס המוח התיכון אבות נוירונים דופאמין. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי להשיג ביטוי יעיל של גנים בעלי עניין לחקור היבטים שונים של התפתחות המוח התיכון והבחנה נוירון דופאמין.
ניסוי זה מדגים אלקטרופורציה in ovo של מוח האמצע של עובר אפרוח כדי לבחון את השפעת ביטוי גנים חיצוניים על התפתחות מוח האמצע ועל התמיינות נוירונים דופמינרגיים. ראשית, מזריקים למוח האמצע של עוברי אפרוח בשלב 11 לפי סולם Hamburger-Hamilton את הפלסמיד הרצוי, DNA, כדי לכוון באופן ספציפי את ה-DNA החיצוני אל תוך שלפוחית מוח האמצע המתפתחת. לאחר מכן, באמצעות אלקטרודות קטנות בהתאמה אישית, מבצעים אלקטרופורציה לשלפוחית מוח האמצע כדי להחדיר את ה-DNA החיצוני באופן ספציפי אל תוך תאי הפרוגניטורים העצביים של מוח האמצע.
בשלב הבא, קצרו עוברים בשלב 23 עם ביטוי M cherry טוב במוח האמצעי והפיקו חתכים רוחביים אופטימליים של המוח האמצעי. לבסוף, ניתוח של צביעה אימונוהיסטוכימית לסמני נוירונים דופמינרגיים כגון tyrosine hydroxylase יכול להראות את ההבדלתו של תאי אב עצביים לנוירונים דופמינרגיים בוגרים, שאינדוקציה שלהם התבצעה על ידי ביטוי של הגנים הרלוונטיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות של electroporation in ovo הוא שפרוטוקול זה יכול להשיג electroporation ספציפי לממברנה כדי לחקור את התהליך של הבדלת נוירונים דופמינרגיים.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחות המוח האמצעי, ניתן ליישמה גם על חלקים אחרים של מערכת העצבים לביצוע אנליזות של מיפוי גורל (fate mapping), ולחקירת הבקרה של ביטוי גנים. כדי להשיג עוברים של hamburger Hamilton בשלב 11, יש להניח כל ביצית מופרית על צדה ולסמן את החלק העליון בקו קצר בעפרון. לאחר מכן, יש להניח את המגשים על נדנדה (rocker) בתוך אינקובטור לח ומחומם מראש.
בדוק את הלחות ואת מפלס המים בכל 24 שעות, בנקודת זמן של 41 שעות לאחר ההפריה (Post fertilization). הוצא את הביצים מהאינקובטור ואחסן אותן בטמפרטורת החדר. נקה את פני השטח של כל ביצה עם 70% ethanol ונגב אותן.
כעת מקמו שתי פיסות של סרט דביק באורך 4 ס"מ זו לצד זו על הביצה כדי ליצור מלבן גדול מעל סימון העיפרון. החליקו את הסרט על הביצה כדי למסגר את החלון באמצעות מזרק של 10 milliliter המחובר למחט במידה 18 gauge. נקבו את קליפת הביצה תוך הטיית המחט הרחק מהחלמון כדי לא להפריע לעובר או לפגוע בו.
שאבו חמישה מיליליטרים של אלבומין מהביצה. נקו את המחט ב-70% ethanol. ייבשו את המחט לפני דקירה של הביצה הבאה.
הזינו את ההגדרות למכשיר משיכת המיקרו-פיפטות בלהבה. לאחר מכן, משכו צינורות קפילריים בע parede דק למחטי הזרקה באמצעות פיפטה P 10. שאבו 5 עד 10 µL של תמיסת פלסמיד לתוך טיפ של פיפטה קפילרית ארוכה.
לאחר מכן, טענו את מחט הזכוכית באיטיות בעמוד רציף ללא בועות אוויר. מקמו את המחט הטעונה במחזיק המחטים המחובר למיקרו-מניפולטור ולמיקרו-אינז'קטור. כעת, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, תוך שימוש ברקע כהה להדגשת המחט, קצצו את המחט באמצעות מספרי קפיץ בנקודה שבה מסתיים הנוזל הירוק.
חתכו חלון בקוטר של שני עד שני וחצי סנטימטרים מחור המחט הקודם, לצורך שאיבת האלבומין. סובבו את הביצה ביד אחת בזמן החיתוך.
זכרו לנקות את המספריים באמצעות נייר Kimwipe ספוג ב-70% ethanol בין ביצה לביצה. המשיכו לצפייה בעובר האפרוח תחת מיקרוסקופ דיסקציה. במידת הצורך, ניתן להדגיש את העובר על ידי הזרקת 20% India ink ב-PBS שעבר סינון של 0.22 micrometer מתחת לעובר האפרוח. מקמו את העובר במקביל למסלול המחט, כאשר הראש פונה הרחק מהמחט.
דקרו באיטיות את צינור העצבים בזווית של 45 מעלות במעבר שבין המוח האמצעי למוח האחורי. התחילו בהזרקה באמצעות מיקרו-מזרקי pico spritzer כאשר משך ההזרקה מוגדר ל-25 milliseconds. התאימו את הזמן בהתאם לחיתוך של המחט, ומלאו רק את שלפוחית העצבים המייצגת את המוח האמצעי ב-plasmid DNA המכיל צבע fast green.
לאחר הוצאת מחט ההזרקה, טפטפו שלוש טיפות של תמיסת pen strep על העובר. ודאו את ההגדרות של מכשיר ה-B-T-X-E-M-C eight 30 electro por לצורך אלקטרופורציה יעילה. במיקום של המוח האמצעי הגחוני (ventral midbrain), מקמו את אלקטרודות הפלטינה הקטנות בצורת L שיוצרו בהתאמה אישית באותו מפלס אופקי של בסיס הצינור העצבי, כך שהמוח האמצעי העוברי יהיה ממורכז בין שתי האלקטרודות.
לחצו פעם אחת על מתג הרגל של ה-BTX ושים לב לבועות האוויר הנוצרות סביב האלקטרודות. לאחר כל ביצוע מוצלח של אלקטרופורציה, הוציאו בזהירות את האלקטרודות מהביצה ונגבו אותן. בעזרת ניגון כימי (chem wipe) טבול ב-70% ethanol, טפטפו שלוש טיפות נוספות של תמיסת pen strep על העובר.
כעת כסו את החלון בחתיכה של סרט דביק שקוף באורך 5 סנטימטר וברוחב 5 סנטימטר. ללא מגע עם תכני הביצה, אטמו את הביצה היטב והחזירו את הביצים לדגרה כאשר השולחנות המסתובבים כבויים. כאשר הושג השלב הרצוי, אספו עוברים חיים אל תוך צלחת פטרי מלאה ב-PBS עבור כל תנאי.
בשלב הבא, נשתמש במיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי. סננו את העוברים שנאספו כדי לזהות ביטוי של m cherry, והעבירו את העוברים החיוביים לבארות בודדות בצלחת 24 בארות. מלאו כל בארה ב-1 mL של 2% paraformaldehyde שהוכן טרי, והדגירו למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 4 °C.
שטפו את העוברים המקובעים ב-PBS 3 פעמים והניחו את העוברים ב-15% sucrose עד לסנכרון בעת שיווי המשקל. חזרו על שיווי המשקל ב-30% sucrose, לאחר מכן הטמיעו כל עובר ב-OCT והכווינו את העוברים כראוי כדי להפיק חתכים רוחביים אופטימליים של המוח האמצעי לצורך ניתוחים עוקבים.
הכינו חתכים בעובי 18 מיקרון באמצעות קריוסטט מאזור המוח האמצעי העבה לצורך אנליזות המשך, במסגרת בדיקת אלקטרופורציה in ovo במוח האמצעי של עובר אפרוח hh. עוברים של אפרוח בשלב 11 מוזרקים עם תערובת פלסמידים הכוללת את הסמן הפלואורסצנטי m cherry, גנים רלוונטיים ומעקב בצבע fast green לתהליך ההזרקה. לאחר האלקטרופורציה של המוח האמצעי, העוברים מדגרו באופן נוסף, והעוברים החיוביים ל-m cherry נאספים, מקובעים ומוטמעים.
לאחר מכן מכינים חתכים קריוגניים של המוח האמצעי. הדגימות נסרקות באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית עם סממנים של המוח האמצעי, כגון tyrosine hydroxylase, בעוברים של אפרוחים שהוזרקו ועברו אלקטרופורציה בהצלחה. ביטוי של M cherry נראה בדרך כלל באזור המוח האמצעי לאחר התפתחות נוספת, כאשר ביטוי ה-m cherry משמש כסמן להזרקה.
עבסים המראים ביטוי תקין של m cherry מקובעים, מוטמעים ומכוונים לצורך הכנת חתכים קריוגניים של המוח האמצעי. כאן, נבדקת הגדרת הגורל הדופמינרגי בפרגנטורים עצביים שעברו אלקטרופורציה על ידי קולוקליזציה של m cherry והגן המסומן ב-flag עם הסמן של נוירונים דופמינרגיים, tyrosine hydroxylase. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להגביל אזורית את ביטוי הגנים לפרגנטורים של נוירונים דופמינרגיים במוח האמצעי העוברי, כולל אופן ההזרקה של מבני DNA באופן ספציפי לאזור המוח האמצעי, וכיצד למקם במדויק את האלקטרופורציה באמצעות אלקטרודות קטנות בהתאמה אישית לאחר ביצוע פרוצדורה זו.
ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון lockdown המתווך על ידי RNI או ביטוי של מחזקים (enhancers) המקושרים לגנים דווחים, כדי לחקור תפקוד גנים ובקרת גנים באזורים ובסוגי תאים ספציפיים של מערכת העצבים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים שיטה לאלקטרופורציה in ovo של DNA פלסמידי לתוך מוכ של עובר אפרוח, במטרה לבחון השפעות של ביטוי גנים על התמיינות נוירונים דופמינרגים. טכניקה זו מאפשרת הובלה ממוקדת של גנים לתאי פרוגניטורים עצביים, ובכך מקלה על חקר התפתחות המוכ.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- ויסות גנים
רקע
- נוירונים דופמינרגיים בגב המוח הם חיוניים לתפקודי מוח שונים.
- הבנת התפתחותם יכולה לספק תובנות לגבי הפרעות נוירולוגיות.
- אלקטרופורציה in ovo היא טכניקה המשמשת להחדרת DNA לעוברים מתפתחים.
- שיטה זו יכולה לשפר מחקרים של ביטוי גנים באזורים ספציפיים במוח.
מטרת המחקר
- להערכת תפקוד גנים במהלך התפתחות נוירונים דופמינרגים במרכז המוח.
- לבחינת הבקרה על גנים המעורבים בדיפרנציאציה נוירונלית.
- לביסוס שיטה מהימנה לחקר התפתחות מרכז המוח.
שיטות שהושתמשו
- הזרקת plasmid DNA למוח האמצעי של עוברי אפרוח.
- אלקטרופורציה באמצעות אלקטרודות מותאמות אישית להשגת העברת גנים.
- קציר של עוברי אפרוח בשלבים התפתחותיים ספציפיים.
- צביעה אימונוהיסטוכימית לסמני נוירונים דופמינרגיים להערכתה של הדיפרנציאציה.
תוצאות עיקריות
- ביטוי מוצלח של גנים בתאי אב עצביים של המוח האמצעי.
- תצפית על דיפרנציאציה של נוירונים דופמינרגיים באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית.
- הדגמת היתרונות של אלקטרופורציה ספציפית לממברנה.
- תובנות לגבי תפקידם של גנים ספציפיים בהתפתחות המוח האמצעי.
מסקנות
- שיטת האלקטרופורציה in ovo יעילה למחקרי ביטוי גנים.
- גישה זו יכולה לקדם את ההבנה של התפתחות נוירונים דופמינרגיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו עבור חקירות גנטיות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ביטוי גנים ממוקד בתאי אב דופמינרגיים במוח האמצעי של עובר אפרוח, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות טיפוליות בהפרעות נוירו-התפתחותיות. על ידי מתן אפשרות למחקרי הגברה או אובדן תפקוד (gain- and loss-of-function) ספציפיים לאזור, השיטה מגבירה את רמת הוודאות החזויה בשלבים מוקדמים של תיקוף המטרה. גישה זו מספקת מערכת רלוונטית למחלה לצורך הערכת תפקוד גנים לפני מאמצים לזיהוי מולקולות מובילה (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות בדיקת תפקוד גנים במסלולי התמיינות של נוירונים דופמינרגים.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגית באמצעות תצפית ישירה על הבשלה של נוירונים חיוביים ל-tyrosine hydroxylase.
- ערך חזוי: תומך בסינון תיקי פיתוח על ידי קישור של מודולציה גנטית לקביעת גורל דופמינרגי במודל של חולייתן.
סקר ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור סריקת תרכובות בהמשך, באמצעות זיהוי תאי פרוגניטורים חיוביים ל-mCherry.
- פלט כמותי: מייצרת קריאות מדידות של צביעה אימונוהיסטוכימית לבדיקת יעילות הדיפרנציאציה דופמינרגית.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תומכת ביישום בר-הרחבה על פני אזורים שונים במערכת העצבים עבור מיפוי גורל תאים ומחקרי בקרה גנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה התפתחות דופמינרגית של הג cooperating midbrain בבני אדם, הרלוונטית למנגנונים של מחלת הפרקינסון וסכיזופרניה.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאישור פרה-קליני באמצעות ביסוס קשרים סיבתיים בין גן לפנוטיפ.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקביעת קריטריונים להתקדמות באמצעות פנוטיפים של דיפרנציאציה הניתנים לשחזור בתאי פרוגניטור שעברו אלקטרופורציה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הטכניקה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת השערות בהתפתחות דופמינרגית לפני שלבי פיתוח הבדיקה וזיהוי המולקולות המובילות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות המשפיעות על גורל תאי מוצא עצביים.
- סריקה: מספק מערכות מוכנות לבדיקה עם טרנספקציה סטנדרטית וניתנת לשחזור בתאי מוצא עצביים של המוח האמצעי.
- אנליטיקה: מספק תוצרי צביעה אימונוהיסטוכימית כמותית (למשל, קו-לוקליזציה של tyrosine hydroxylase) להשוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית באמצעות מדדי בידול של נוירונים דופמינרגיים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית למחקרי ביטוי גנים אזוריים במערכות משנה של מערכת העצבים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבואי בתיקוף המטרה באמצעות תצפית ישירה עלהבחנה דופמינרגית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה באמצעות אלקטרופורציה מוגבלת אזורית ומעקב אחר ביטוי mCherry.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי צמצום העמימות המכניסטית במטרות של התפתחות נוירולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף מותאם סיכונים המבוסס על השפעות גנים במודל מאומת של נוירונים דופמינרגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בעוברי רפאים ובטכניקות של מיקרו-כירורגיה.
- תלוי באלקטרודות פלטינה מותאמות אישית בצורת L ובהגדרות מדויקות של מכשיר האלקטרופורציה.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים של קיבוע, חיתוך וצביעה אימונוהיסטוכימית לצורך ניתוח הדיר.
- התאמה לאזורים עצביים אחרים דורשת אופטימיזציה מחדש של אתרי ההזרקה ומיקום האלקטרודות.
- מגבלות מעשיות כוללות אילוצים של חיות העובר ויחס אות לרעש בדימות של רקמות עמוקות.
