הכנת פקטור T צמיחת תאים מן Splenocytes עכברוש
31 באוקטובר 2007
אנו מתארים את הכנת גורם תא T צמיחה המשמש הרחבה של מבחנה של אנטיגן ספציפי לערמונית קווי עכברוש T לימפוציטים.
שלום, אני כריסטין ביטון. אני עזרת מחקר במעבדה של ג'ורג' צ'ן במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה של אוניברסיטת קליפורניה באירוואין. ובשני הימים הבאים אראה לכם כיצד להכין TCGF, שהוא קיצור של T cell growth factor.
לכן, עבור תרביות תאים שגרתיות, כאשר איננו זקוקים לידע מדויק על הרכב הציטוקינים במצע התרבית, אנו משתמשים ב-T-cell growth factor, שהוא על-נוזל (supernatant) מתרבית של תאי טחול, המכיל את הציטוקינים הדרושים לסיוע בהתרחבות תאי ה-T. דרך ההכנה של ה-TCGF היא על ידי הוצאת הטחול מחולדות Lewis בריאות, הכנת תרחיף של תאים בודדים, הסרת תאי הדם האדומים באמצעות ליזיס, ולאחר מכן גירוי של התאים המונונוקליאריים באמצעות Con A (Concanavalin A), אשר יעניק גירוי לתאי ה-T להפיק את כל הציטוקינים הדרושים לצמיחתם. כדי להפיק את ה-TCGF, עלינו להפעיל את התאים.
הדרך שבה אנו מבצעים זאת היא על ידי הוספת לקטין Concanavalin A, המקוצר כ-Con A, לתרבית התאים שלנו. כאשר אנו מוסיפים Con A לתרבית התאים, הוא נקשר לקומפלקס הקולטן של תאי T הגליקוזילציה, ובשל הקישור למספר קומפלקסים בו-זמנית, הוא יבצע תהליך הנקרא capping. כך הוא יגרום לאגרגציה, ויצור צבר של כל הקולטנים על פני השטח של התא, דבר שישרה אות פעולה בלימפוציטים מסוג T.
לאחר שהתאים הופכים לפעילים, הם יעברו תהליך של blast. כלומר, הם יגדלו ואז יתחילו להפריש ציטוקינים. בתחילה חשבנו ש-TCGF הוא בעיקר interleukin two, אך כיום אנו יודעים שזה לאו דווקא המקרה.
הוא מכיל גם interferon gamma, TNF alpha וכנראה גם cytokines בכמויות קטנות מאוד, הנחוצות רק כדי לשמור על חיוניות התאים לאחר 48 שעות בתרבית; התאים ייצרו את כל ה-cytokines הדרושים לנו. לכן, אנו עומדים להסיר את התאים, וכשנסיר אותם ונשאר עם supernatant בלבד, עדיין יישאר חלק מה-conal החופשי ב-snat. דבר זה יהווה בעיה, מכיוון שאנו מעוניינים להשתמש ב-T-cell growth factor שלנו כדי לשמור על צמיחתם של קווי תאי T.
ואם נשאיר את ה-concanavalin חופשי שם, הוא יפעיל את התאים כאשר איננו רוצים שהם יופעלו. לכן, כדי לפתור בעיה זו, נוסיף עודף של סוכר שייקשר לכל ה-concanavalin החופשי בתוך התמיסה. כך הוא יהיה מושבת לחלוטין ולא ייקשר לקולטנים גליקוזילים אחרים על התאים כאשר נוסיף את ה-TCGF לתרבית.
אם כן, נתחיל. השלב הראשון בניסוי זה הוא הוצאת הטחול מהחולדה מיד לאחר ההמתה. זה מה שאעשה כעת באמצעות מכשירים סטריליים.
ברגע שהוצאתי את הטחולים, אני אעביר אותם ל-PBS מועשר באנטיביוטיקה, ובאשר לאנטיביוטיקה אני משתמש בפניצילין וסטריפטומייצין. אז בואו נתחיל. אני מרסס את החולדה ב-70% ethanol כדי להבטיח שלא תהיה כל זיהום של התרבית שלי.
כעת, באמצעות המכשירים שלי, אבצע חתך קטן בעור כאן. לאחר מכן אסיר שכבת שריר והטחול יופיע ממש כאן. אני לוקח פינצטה אחרת ומושך בעדינות את הטחול החוצה מבלי לפגוע בו.
אני מסיר את הרקמה החיבורית באופן הזה. כעת יש לי את הטחול. כמובן, אני נזהר מאוד לא לפגוע בדבר אחר בתוך חלל הבטן, מכיוון שכל פגיעה במעי תוביל לזיהום מיידי של הטחול שלי.
כעת אעביר את הטחול לשפופרת המכילה PBS בתוספת אנטיביוטיקה. שפופרת זו אשמור על קרח. כעת השגתי את הטחולים משלוש חולדות.
כעת אנו מוכנים להכין תרחיף של תאים בודדים מהטחולים הללו. כעת, לאחר שיש לי את הטחולים, העברתי אותם למנדף תרביות רקמה כדי להכין מהם תרחיף של תאים בודדים באמצעות מסנני תאים של 70 מיקרון. אדרש למספר דברים כדי להכין את תרחיף התאים הבודדים מהטחולים.
אני זקוקה למכשרים סטריליים, זוג פינצטות וזוג מספריים. לאחר מכן, הנחתי את הבוכנה של מזרק סטרילי של 1 mL בתוך פטריה.
ובפיתריה נוספת הנחתי מסנן תאים של 70 מיקרון ב-10 milliliters של PBS בתוספת אנטיביוטיקה. השלב הראשון הוא לוודא שהטחולים נקיים, כיוון שכפי שניתן לראות כאן, ישנם עדיין חתיכות קטנות של רקמה חיבורית ואני אסיר אותן כיוון שהן יסתימו את מסנן התאים במהירות. לשם כך, אני פשוט חותך את החלקים שאינם רצויים ומשליך אותם אל מכסה הפיתריה.
כעת, כאשר הטחולים נקיים ברובם, אני אקח את הטחולים אחד אחד, אעביר אותם למסנן התאים (cell trainer) ואחתוך אותם לחתיכות קטנות, ואערבב את שלושת הטחולים. השלב הבא הוא יצירת סספנסיה של תאים בודדים. כדי להבטיח שכל התהליך יהיה סטרילי, אני לא אגע כלל במסנן התאים ואשתמש בבוכנה של מזרק סטרילי של 1 ml כדי לדחוס את חתיכות הטחול דרך מסנן התאים.
וכפי שניתן לראות בחלקו החיצוני של מכשיר הריסוק (cell trainer), אני מכין תרחיף של תאים בודדים. בסיבוב הראשון עדיין נשארו כמה חתיכות קטנות של טחול, אך אני כבר הולך להוציא את תרחיף התאים הבודדים. כבר העברתי אותו לשפורת של 50 mil השמורה על קרח.
כעת אמלא שוב את מסנני התאים ב-10 mL נוספים של PBS ואנטיביוטיקה. לכן, אקח כ-10 mL נוספים של PBS עם אנטיביוטיקה; זה לא חייב להיות בדיוק 10 mL, שכן אנו רק שוטפים. אשפוך זאת לתוך מסנני התאים ואוסיף להשתמש באותו הליך.
אני חוזר לבוכנה של המזרק ולוחץ דרך ה-ocid מעט יותר. כמובן שמעולם לא תצליחו להעביר הכל מכיוון שיש רקמות חיבור וחלקי שומן קטנים שלא הצלחתי להסיר ויישארו במסננת התאים. אך אתם אמורים להעביר את רוב הטחול למסננת התאים.
כעת אני חוזר בדיוק על הפעולות שביצעתי קודם לכן. אני אקצור את תרחיף התאים הבודדים שלי ואוסיף אותו לאותה השן. בשלב זה כמעט ולא נותר דבר מהמסננת בתוך מסננת התאים, וה-PBS שיוצא צלול הרבה יותר. אני פשוט אשטוף פעם נוספת, וכעת רוב התאים אמורים להיות בחוץ.
כעת יש לי תרחיף של תאי PLE בודדים, ואני אסובב אותם בצנטריפוגה פשוט כדי להשקיע אותם למשקע. סבוב למשך 8 עד 10 דקות יספיק. כעת סובבנו את תאי ה-PLE ויש לנו משקע יפה.
לכן, מה שאעשה הוא להסיר את הנוזל העליון ולאחר מכן אבצע ליזיס לתאי הדם האדומים. אני אשעה את המיוציטים בתוך אמוןיום כלוריד. זהו תמיסה של 0.15 molar אמוןיום כלוריד, ואשתמש ב-5 mL לכל טחול.
מכיוון שיש לי שלושה טחולים, אשתמש ב-15 milliliters של ammonium chloride ואעשה זאת על קרח. כדי לפרק את האריתרוציטים, אעביר את הנוזל בעדינות למעלה ולמטה בעזרת פיפטה במשך שלוש דקות. אוקיי, נשתמש במיקרוסקופ זה עם החשיפה הגבוהה יותר כאן.
כעת סיימתי לנתח את האלקטרוציטים במשך שלוש דקות. אני עומד למלא את המבחנה ב-PBS, או שניתן להשתמש גם במצע גידול. זאת כדי להחזיר את האוסמולריות של התמיסה לטווח הנורמלי עבור התאים.
אני אסחרר את התאים למטה, כפי שעשיתי קודם לכן, למשך 8 עד 10 דקות כדי להשקיע אותם. לאחר מכן, אשטוף אותם פעמיים באמצעות אותו PBS עם אנטיביוטיקה. כעת אנו מסחררים את התאים לאחר שחרור האלקטרוציטים, ואל תדאגו – אנחנו אף פעם לא מקבלים שחרור של מאה אחוז מהאלקטרוציטים.
כך המשקע עדיין יהיה אדום, אך הנוזל העליון יהיה צלול יותר. כעת ארוקן את הנוזל העליון, אפריס את המשקע, אוסיף PBS עד לנפח של 50 ml, אסחר ואחזור על השלב הזה פעם נוספת כדי שיהיו שני שטיפות. לאחר מכן אוכל לספור אותם. שטחתי את המיוציטים פעמיים, לאחר מכן תליתי אותם במצע גידול וספרתי אותם באמצעות ציטומטר.
כמצופה. משלושה טחולים קיבלתי כ-600 מיליון תאים, וזה צפוי כיוון שטחול אחד מספק בדרך כלל 200 עד 250 מיליון תאים. לכן, כעת אני הולך לזרוע את התאים בריכוז של 2 מיליון למ"ל במצע המעשיר ב-10% fetal calf serum.
ולמדיום זה אני עומד להוסיף 2 µg/mL של conc A כדי לעורר את התאים. לאחר מכן, אני פשוט אכניס את התאים לאינקובטור למשך 48 שעות. התאים שהו את התאים באינקובטור במשך 48 שעות וכפי שאראה לכם, הם גדלו היטב.
המצע הפך לכתום. לפיכך, אנו מוכנים כעת להשלים את ההכנה עבור ה-TCGF. כפי שאתם זוכרים, הוספתי con carnaval לתליה התאית שלי כדי להפעיל את התאים.
אם כך, ה-concanavalin A הוא לקטין. הוא ייקשר לסוכרים על פני כל הרצפטורים של תאי ה-T ויפעיל באופן מלאכותי את כל התאים הללו. הבעיה העומדת בפנינו כעת היא שעדיין נשאר חלק מה-concanavalin A בנוזל העל של התאים.
ומכיוון שאנו עומדים להשתמש ב-snat בתרביות T cell אחרות כדי להרחיב את התאים, איננו רוצים ש-con carnaval in יהיה נוכח בתרביות תאים אלו. לכן, כדי להיפטר ממנו, אני אוסיף עודף של סוכר שאליו con naval in נקשר, וזהו methyl alpha D cyte המוצג כאן. אני אוסיף עודף של סוכר זה ואהמסס אותו לחלוטין.
זה יקשור את כל ה-conc naval שנותר, ולאחר מכן אבצע סינון סטרילי לת上-סופרנטט של התאים ואקפיא את כל הנוזלים לשימוש בשבועות או חודשים הבאים. בואו נתחיל בשלב האחרון הזה. אני מוסיפה את הסופרנטט של תרבית התאים למבחנות בנפח 50 mil כדי שניתן יהיה לסבב אותן ולהיפטר מהתאים.
לכן אני פשוט ממלא כמה מבחנות ככל שנדרש, ואני לא עושה זאת בתוך מנדף התרביות; אני יכול הייתי, אך מכיוון שבכל מקרה אצטרך לסנן את התמיסה שלי בסוף בגלל הוספת הסוכר, שאינו סטרילי, אני פשוט עושה זאת על השולחן. זה קל יותר. כעת שפכתי את כל התאים והעל-נוזל (supernatant) למבחנות הפאלקון בנפח 50 mil.
כעת אעביר אותם לצנטריפוגה ואסבב אותם למשך כ-10 דקות. הסיבה היחידה לסבבבם היא כדי לשקיע את התאים למשקע, כך שיהיו לי עיליים צלולים. התאים שקעו כעת, ולכן העילי הוא צלול, וזהו החלק שרציתי לאסוף.
כעת אאסוף את כל הנוזל העליון (supernatant) לתוך בקבוק תרבית נקי של 150 סמ"ר. לבקבוק זה אוסיף את הסוכר. בזמן שהתאים הופרדו בצנטריפוגה, שקלתי כמות סוכר מספיקה להוספה של 15 mg/ml של הנוזל העליון.
אני אתן לזה להימסס לחלוטין, ולאחר מכן אבצע סינון סטרילי לנוזל העליון. כעת אני אוסיף את הסוכר בריכוז של 15 milligram per ml של הנוזל העליון. אני מחזירה את הפקק, ומכיוון שאיני עובדת בתנאים סטריליים, אין זה משנה אם חלק מהחומר יגיע אל הפקק, לכן אערבב עד שכל הסוכר יתרסס.
זה אמור להיות די מהיר. כן, כל הסוכר מומס כעת. לכן, כל שעלי הוא לסנן באופן סטרילי את העילאי (supernatant) ואז אחלק אותו למנות (aliquot).
בדרך כלל אני מכין מנות (aliquots) של 10 עד 15 ml השומר אותן בטמפרטורה של 20- מעלות. מנות כאלו ניתן לשמור למשך מספר חודשים. ניתן גם לשמור את ה-TCGF במקרר, אך במקרה כזה אשתמש בו במהלך 10 עד 15 הימים הבאים.
במהלך היומיים האחרונים, הדגמתי לכם כיצד להכין גורם גדילה לתאי T; עלנוני זה פשוט מאוד להכנה וזול מאוד להפקה. לכן, אנו משתמשים בו לעיתים קרובות במעבדה כדי לתחזק את שורות תאי ה-T שלנו בתרבית, מבלי שנצטרך לרכוש תערובות יקרות של ציטוקינים. בהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את הכנת גורם גדילה של תאי T (TCGF) המשמש להרחבה in vitro של שורות תאי לימפוציטים T ספציפיים לאנטיגן מחולדה. התהליך כולל איסוף וגירוי של תאים חד-גרעיים מהטחול של חולדות בריאות כדי להפיק את הציטוקינים הדרושים לצמיחת תאי T.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- מחקר ציטוקינים
רקע
- גורם גדילה של תאי T חיוני להתרחבות תאי T in vitro.
- חולדות בריאות משמשות כמקור לתאי טחול.
- הפעלה של תאי T נחוצה לייצור ציטוקינים.
- הבנת TCGF יכולה לסייע במחקרים ובטיפולים אימונולוגיים.
מטרת המחקר
- להדגים את הכנת TCGF לתרבית תאי T.
- לספק פרוטוקול לחוקרים להרחבת לימפוציטים T ספציפיים לאנטיגן.
- להדגיש את חשיבותן של ציטוקינים בצמיחת תאי T.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף טחולים מחולדות Louis בריאות.
- הכנת תרחיף של תאים בודדים מרקמת הטחול.
- הסרת תאי דם אדומים מהתרחיף.
- סטימולציה של תאים חד-גרעיניים באמצעות concanavalin A.
תוצאות עיקריות
- הפעלה מוצלחת של תאי T המובילה לייצור ציטוקינים.
- הכנת TCGF התומך בהתרחבות תאי T.
- הדגמת יעילות השיטה עבור מחקרים in vitro.
- אספקת פרוטוקול הניתן לשחזור עבור חוקרים.
מסקנות
- TCGF חיוני לצמיחה של לימפוציטים T ספציפיים לאנטיגן.
- השיטה המתוארת היא יעילה ופשוטה.
- פרוטוקול זה יכול לקדם מחקרים באימונולוגיה ובביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
הכנת גורם צמיחה של תאי T (TCGF) מספלנוציטים של חולדה מספקת חלופה חסכונית ועשירה בציטוקינים לאינטרלוקין-2 רקומביננטי לשמירה על קווי תאי T ספציפיים לאנטיגן in vitro. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של הגילוי על ידי מתן אפשרות להרחבה אמינה של תאי T ללא הטיה של ציטוקינים חיצוניים, ובכך משפרת את רמת הוודאות החזויה במבחנים אימונולוגייםים. יכולת ההרחבה והשחזור של השיטה הופכות אותה למתאימה לשילוב בתהליכי עבודה של גילוי הדורשים תנאי תרבית עקביים של תאי T.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות תלויות T-cells על ידי אספקת סביבת ציטוקינים פיזיולוגית לתחזוקת T-cells ספציפיים לאנטיגן.
- ערך תפעולי: מפחית את ההסתמכות על ציטוקינים רקומביננטיים יקרים, ובכך מוריד את עלויות הרכיבים בסריקות של תיקוף מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יצירת על-נוזלים (supernatants) סטנדרטיים המוגדרים על ידי ציטוקינים, התומכים במבחני ת proliferation של תאי T הניתנים לשחזור.
- ערך תפעולי: מאפשר התרחבות של המבחן באמצעות הכנה של מנות גדולות ואחסון לטווח ארוך ב-20°C-.
מחקר תרגומי ו-preclinical
- ערך מדעי: תומך בהמשכיות פרה-קלינית על ידי שמירה של קווי תאי T פונקציונליים למחקרי יעילות ומנגנוני פעולה המשכיים.
- ערך תפעולי: ממזער את השונות בין סדרות (batches) בתרביות של תאי T, ובכך משפר את עקביות הנתונים בניסויים תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
הכנת TCGF נכללת ברצף הגילוי, החל מאימות מוקדם של מטרות תאי T, דרך פיתוח מבחנים ועד לאימות פרה-קליני, שבו נדרש תרבית ממושכת של תאי T לצורך קריאות תפקודיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי אספקת סביבת ציטוקינים טבעית המונעת קיטוב מלאכותי הנראה בשימוש ב-IL-2 בלבד.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של הרחבת תאי T, החיוניות לאישור פגיעות (hit confirmation) וזיהוי מובילים (lead identification).
- אנליזה: מאפשר מדידה של התרבות תאים תלוית ציטוקינים כקריאה תפקודית לסריקת תרכובות אימונומודולטוריות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי שימור הפנוטיפ והתפקוד של תאי T לצורך תיקוף המנגנון.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית לייצור ציטוקינים הישימה עבור פרויקטים מרובים המכוונים לתאי T.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בתגובות המתווכות על ידי תאי T.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות הכנה מוגדרת ונטרול של מיטוגן שיורי.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי החלפת תערובות ציטוקינים יקרות בחלופה המיוצרת במעבדה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון על ידי הבטחת תנאי תרבית אמינים של תאי T בכל הפרויקטים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות רקמה אספטיות ובעיבוד טחול של מכרסמים.
- תלוי בתשתיות של סבב (צנטריפוגציה), סינון סטרילי וספירת תאים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של נטרול מיטוגנים באמצעות alpha methyl mannoside.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת הפרוטוקול לזני חולדות שונים או למינים אחרים.
- מוגבל על ידי חלון ייצור ציטוקינים של 48 שעות והתלות בבידודים טריים של ספלנוציטים.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
10:23
Lysis of Red Blood Cells
0:00
Title
12:40
Preparing Splenocyte Culture
0:06
Introduction
17:53
Conclusion
1:13
TCGF Secretion
3:22
Harvesting Spleens from Lewis Rats
13:34
Elimination of the Conconavalin A
5:15
Preparing Single Cell Suspensions from Rat Spleens
