זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

גדילה של גדיל שלילי, נגיפי RNA. הגנום של נגיפי השפעת ארוז בצורת קומפלקסים של ריבונוקלאו-פרוטאין נגיפיים, או VR npס, שבהם הגנום החד-גדילי עטוף בחלבון גרעיני ומקושר לקומפלקס הפולימראז המורכב מתתי היחידות PA, PB1 ו-PB2. כדי לטהר קומפלקסים שלמים מתאי יונקים נגועים, מדגרי תאי HeLa עם נגיף שפעת רקומביננטי המסומן ב-strep tag.

לאחר שהנגיף חודר לתאים, ה-RNA הנגיפי מסונתז בגרעינים בעקבות הזיהום; התאים מולyses באמצעות דטרגנט ומופרדים לפרקציות ציטופלזמיות, גרעיניות ופרקציות של כרומטין באמצעות סרצ'יפוגציה ופרוטוקול לבידוד כרומטין מבוסס מלחים. לבסוף, VRPs עם תג strept מופקים בטיהור זיקה (affinity purification) מכל פרקציה. ניתוח של הרכב החלבון וה-RNA של VRNPs מופקים באמצעות צביעת כסף מדגים כי באמצעות פרוטוקול זה ניתן לבודד VRPs הקשורים חזק לכרומטין כשהם שלמים. לפיכך, אחד היתרונות המרכזיים של הפרוטוקול שלנו בהשוואה לשיטות סטנדרטיות לטיהור זיקה של קומפלקסים של חלבון ריבו-נוקלאים של נגיף השפעת הוא שבשימוש בשיטה שלנו, ניתן לטהר VRNPs מהכרומטין של תאים מזוהמים, הידוע כאתר הסינתזה של mRNA של נגיף השפעת.

לפיכך, ניתן להשתמש בשיטה שלנו כדי לענות על שאלות הנוגעות לבקרה על השכפול והשעתוק הוויראליים, כגון, לדוגמה, אילו גורמים ויראליים או תאיים, ואילו מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות נדרשות, למשל, עבור סינתזה של mRNA ויראלי או סינתזה של RNA גנומי ויראלי. חוקרים שאינם מכירים את השיטה עשויים להיתקל בקשיים, כיוון שפרקציונציית תת-גרעינית רגישה מאוד לתנאים ביוכימיים והיא עשויה להשתנות במידה ניכרת בין קווי תאים שונים. התחילו את הפרוטוקול עם תאי HeLa שהודבקו בנגיף שפעת, RWSN PB2 strep, שבו תג strep מחובר גנטית לקצה C של תת-היחידה PB2 בריבוי הדבקה (MOI) של 3.

שטפו את התאים פעם אחת ב-PBS קר, לאחר מכן הוסיפו 12 milliliters של PBS קר והסירו אותם מהצלחת באמצעות מגרדת גומי. העבירו את התאים לנבוב קוני של 50 milliliter ורספו אותם באמצעות סרכזה.

ההיבט הקשה ביותר בפרוצדורה זו הוא פרוטוקול הפרקציונציה של התאים. גרעיני תאים רגישים מאוד להליכי הומוגניזציה וערבוב, וביצוע שגוי של אלו עלול להרוס בקלות תמצית כרומטין. לכן, חשוב מאוד להקפיד לא רק על טכניקות ההומוגניזציה, אלא גם על הטיפול הכללי בליזאטים כפי שמוצג כאן.

לאחר ספינינג, שאיבת הנוזל, ה-PBS וה-Resus, השעה את משקע התאים ב-10 milliliters של בופר סוכרוז קר. הצמד טיפ של פיפט של 200 microliter לפיפט סרום פלסטי של 10 milliliter והעבר את התאים דרכו כדי לפרק גושי תאים. דגירה את התושה על קרח למשך 10 דקות.

הפוך את התאים בעדינות ובאופן מחזורי כדי להחזירם לסספנסיה. לאחר מכן, הוסף non IET P 40 עד לריכוז סופי של 0.5% ובצע וורטקס במהירות גבוהה למשך 15 שניות; מיד לאחר מכן, סבב בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-3,500 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחנית. לאחר הסבב, הסר את העלייה העליונה (supernatant) והעבר אותה לשפופרת קונוית של 15 מיליליטר.

יש לאחסן את הנוזל העליון בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. זהו שבר ציטופלזמי. המשקע צריך להיות קטן ולבן יותר ממשקע התאים המקורי, כפי שמוצג כאן.

אם הפרוטוקול יושלם במועד מאוחר יותר, יש לאחסן את משקע התאים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. אחרת, יש להמשיך בשטיפת המשקע בחמישה מיליליטר של תמיסת סוכרוז קרה, באפר, וסבוב בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן. עם סיום הסבוב, יש להשליך את העלייה ולפתוח מחדש את המשקע, המכיל את הגרעינים, ב-1.5 מיליליטר של באפר קריו-מיצוי פלזמה גרעינית.

העבירו את המשקע שהושעה להומוגניזר זכוכית מקורר בנפח 4 ml עם עלי פיתול (pestle) בעל התאמה הדוקה, והומוגניזו את הגרעינים באמצעות 20 תנועות. תוך הימנעות מהיווצרות קצף, ההתנגדות צריכה לעלות לאחר כ-10 תנועות. כדי לוודא הומוגניזציה יעילה, בחנו את הדגימה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase contrast).

הגרעינים לא אמורים להיות עגולים עוד, אלא בעלי צורות לא סדירות ולהיראות כאילו התפוצצו. לאחר שהגרעינים עברו הומוגניזציה, העבירו אותם למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter. דגרו את ההומוגנאט על גלגל סיבוב בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius למשך 20 דקות.

לאחר מכן, סבבו במרכזפוגה מיקרוסקופית ב-16,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסבוב, העבירו את העלייה, שהיא פראקציית הנוקלאופלזמה, למבחנה של 1.5 ml, ואחסנו אותה ב-4 °C. לאחר מכן, השעיקו מחדש את המשקע ב-1.5 ml של בופר עיכול שחומם מראש ל-37 °C.

לאחר מכן, הדגרו את הפракציה למשך 10 דקות ב-37 °C. בשלב הבא, הוסיפו 42 µL של sodium chloride בריכוז 5 M כדי להביא את הריכוז הסופי של sodium chloride ל-150 mM, ולאחר מכן הדגרו למשך 20 דקות על קרח. סבבו בצנטריפוגה ב-16,000 ×g במיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות.

לאחר הסרכזג, הסר את הנוזל העליון ושמור אותו בטמפרטורה של 4°C. זהו חלק ה-CH one 50. השהה את המשקע ב-1.5 ml של בופר מלח גבוה קר והדגר למשך 20 דקות על קרח.

סבב במערכת צנטריפוגה מיקרובית במהירות של 16,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הסבב, הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושמור אותו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. זהו פראקציית ה-CH 500.

הוציאו את הפראקציות שנשמרו במהלך פרוטוקול הפרקציונציה והניחו אותן על קרח. לאחר מכן, הוסיפו לפראקציה הציטופלזמית 300 µL של sodium chloride בריכוז 5 M. לאחר מכן, העבירו 100 µL של strep T דחוס ב-Sphero beads מכל פראקציה לשפופרת קונית בנפח 15 mL.

הוסף 10 נפחים של strep wash buffer לחרוזי השרף. הפוך את המבחנה כדי לערבב וסבב במערך צנטריפוגה שולחנית למשך חמש דקות במהירות של 1000 ×g, והסר את הנוזל העליון.

חזרו על שטיפת התמיכה פעמיים, ולאחר מכן השעיו את המשקע בנפח שווה של strep wash buffer, והוסיפו 200 µL של washed streps Act in bead slurry לכל פракציה. סובבו את המבחנות במשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, סבבבבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-1000 ×g בטמפרטורה של 4 °C, והסירו את supernatant.

לאחר מכן, הוסף מילליטר אחד של בופר שטיפה לחרוצים שדגרו עם הפראקציה הציטופלזמית במבחנה של 15 מילליטר. הוסף את בופר השטיפה והעבר את החרוצים למבחנה של 1.5 מילליטר. שטוף את החרוצים למשך דקה אחת, ולאחר מכן סבב את המבחנות בצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 1000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס (°C).

חזור על הפעולה פעמיים לאחר שלב השטיפה האחרון. הסר את כל שאריות תמיסת השטיפה באמצעות טיפ של פיפט שטוח. לאחר מכן, הוסף 100 microliters של תמיסת אלוציה, ערבב בעדינות והנח את המבחנות על קרח למשך 15 דקות.

במהלך הדגירה, ערבבו מדי פעם את החרוזיים על ידי הקישה עדינה על תחתית המבחנות. לאחר שעברו 15 דקות, צנטריפוגו כדי להפריד למשך דקה אחת ב-1000 ×g בטמפרטורה של 4 °C. אספו את הסופרנאנט המכיל את ה-VRPs עם תג strep שנשטפו.

התאים שלנו הוזנקו עם זן של נגיף השפעת, WSN למשך תשע שעות, והליזאטים המופרדים נותחו באמצעות western blotting כפי שמוצג כאן. בידוד גרעיני עדין מחלץ ביעילות חלבונים ציטופלזמיים כגון tubulin תוך מניעת שחרור של חלבונים גרעיניים שכיחים. שימו לב שפרקציית הכרומטין שהופרדה במלח בריכוז נמוך עשירה בחלבונים החשובים לתעתוק.

בעוד ששבר המלח הריכוזי מכיל בעיקר נוקלאוזומים, כדי לקבוע את הרכב החלבונים של שבר הציטופלזמה שנשטף, נותחו v RNPs מתאי R שהודבקו במשך תשע שעות עם וירוס ללא תג, RWSN או RWSN PB two strep באמצעות צביעת כסף, כפי שמוצג עבור תמצית ציטופלזמית. כאן קיים יחס גבוה של NP ביחס ל-PA PB one, PB two, כפי שמעידה הפס המרכזית מעל 55 kilodaltons בהשוואה לפסים שבין 95 ל-100 kilodaltons, מה שמרמז שרוב ה-strep PB two מטוהר כחלק מ-vRNP גבשוה, או במילים אחרות, מעט פולימראז מסיס נלכד לצורך השוואת תנובות יחסיות. v RNPs שטוהרו לאחר תשע שעות של הדבקה עם RWSN PB two strep או RWSN נצבעו בכסף כפי שמוצג בג'ל צביעת הכסף זה; ניתן לטהר v RNPs מכל ארבעת השברים התאיים לאחר תשע שעות של הדבקה.

הריכוז הגבוה ביותר של v RMPs נמצא בתוך הפלסמה הגרעינית, אם כי ניתן לטהר כמויות משמעותיות גם מהציטופלזמה ומהכרומטין. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לטהר תנובות גבוהות של קומפלקסים של ריבנוקלאופרוטאין של נגיף השפעת שלמים מהגרעין של תאים נגועים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בבופרים נקיים ולהימנע מחשיפה מיותרת של הדגימות לטמפרטורת החדר, וזאת כדי למנוע פירוק של ה-RNA והחלבונים, כמו גם כדי למנוע פירוק של קומפלקס החלבון.

ואל תשכחו שהעבודה עם נגיף שפעת מידבק עלולה להיות מסוכנת. יש לבצע את כל השלבים תחת עמדת עבודה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (biosafety level two) עד להוספת NP 40 לליזאטים.