בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד במהירות תאי דנדריטיים של המעי בעכבר (dcs) ומקרופאגים לצורך אפיון פנוטיפי ותפקודי. זאת מושג תחילה על ידי קצירת רקמת מעי. השלב השני הוא הפרדת אפיתל המעי מה-lamina propria.

בשלב הבא, ה-Lamina Propria של המעי עוברת עיכול במהלך השלבים הסופיים של הפרוצדורה. תאי ה-Lamina propria נצבעים באמצעות פלואורסצנציה ונוגדנים מצומדים, ומסוננים (gated) לאוכלוסיות תאים ספציפיות. בסופו של דבר, ניתן לאפיין באופן מדויק יותר את אוכלוסיות ה-DC והמקרופאגים של המעי ולטהרן לצורך מחקרים פונקציונליים להערכת ייצור ציטוקינים, הצגת אנטיגן וויסות של תאי מערכת החיסון.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שמהירות עיכול הרקמה מבטיחה ביטוי אופטימלי של אנטיגנים על פני השטח של התא, חיוניות התאים, ו/או תקינות תאית. לאחר קריאת העכבר ואישור המוות באמצעות רפלקס צביטה באצבע, רסס 70%ethanol על הבטן והחזה של בעל החיים. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לבצע חתך אופקי קטן במרכז הבטן וקלף את העור כדי לחשוף את הפריטוניאום.

פתחו את הפריטוניום באמצעות מספריים לאחר חיתוך בספינקטר הפילורי כדי להפריד את הקיבה מהמעי הדק העליון, והשתמשו בפינצטה להרחקה עדינה של המזנטריון. חתכו שוב בשסתום המעי הדק-מעי הגס (ileocecal valve) כדי לשחרר את כל המעי הדק מהמעי הגס. המשיכו להפריד בעדינות את המזנטריון מהמעי הגס ובצעו חיתוך בפתח פיח השרירי (anal verge).

השתמשו במספריים כדי לחתוך את המעי הגס לאורכו והשתמשו ב-C-M-F-P-B-S בטמפרטורת החדר כדי לשטוף את תכולת הצואה והריר מתוך הלומן של המעי. לאחר מכן, השתמשו במספריים ובפינצטה כדי להוציא בבדיקה מאקרוסקופית את פסי פייר (Peyer's patches) לאורך המשטח האנטי-מזנטרי של המעי הדק, וחיתכו את המעי הדק לאורכו.

בשלב הבא, נקה את חלל המעי הדק מתכנים צואתיים ומרירי באמצעות תמיסת C-M-F-P-B-S נוספת בטמפרטורת החדר. בנפרד, חתוך את המעיים הדקים והעבים לחתיכות של כ-1.5 סנטימטר והנח את החתיכות לשפופרות קוניות של 50 מיליליטר בנפרד, המכילות 30 מיליליטר של תמיסת C-M-F-H-B-S-S שהוכנה מראש עם FBS ו-2 מילימול EDTA. הנח כל שפופרת קונית של 50 מיליליטר במצב אופקי בתוך שייקר אורביטלי המטלטל את השפופרות ב-250 RPM למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

כעת הניחו מסננת רשת בודדת מעל דלי פסולת. שפכו את התוכן של כל מבחנה קונית של 50 milliliters דרך הרשת כדי לאסוף את חלקי המעי, ולאחר מכן העבירו אותם למבחנות קוניות חדשות ובודדות של 50 milliliters המכילות 30 milliliters של Prewarm C-M-F-H-B-S-S with FBS עם 2 millimolar EDTA. לבסוף, החזירו את המבחנות למנער האורביטלי למשך 20 דקות נוספות.

לאחר סבב השנייה של הנעורה, שפכו את תכולת כל מבחנה דרך המסננת. שוב, ספגו את עודפי המצע באמצעות נייר סופג, ואז העבירו את חלקי המעי לכלי פלסטיק קטן (whey boat). ההיבט המאתגר ביותר בטכניקה זו הוא עיכול הרקמה; כדי להבטיח הצלחה, יש לשקול את כל הפרמטרים השונים של משך העיכול, תכונות ה-collagenase, שלמות הרקמה וגודל הרקמה שיועכלו, תוך שימוש מהיר במספריים.

קצצו את חלקי המעי ולאחר מכן העבירו את המעי הקצוץ אל מבחנה קונית של 50 millimeter המכילה 20 milliliters של תמיסת קולגנאז. הניחו את המבחנה הקונית בצורה אופקית בתוך שייקר אורביטלי ועזרו את חלקי המעי ב-200 RPM למשך 10 עד 20 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. כעת בצעו וורטקס קצר למבחנה כדי להבטיח דיסוציאציה יסודית של כל רקמת מעי שנותרה, ולאחר מכן סננו את תמיסת התאים דרך מסנן תאים של 100 micron ישירות אל מבחנה קונית של 50 milliliter.

לבסוף, מלאו את השפופרה הקונית עד הסוף ב-C-M-F-H-B-S-S עם FBS וסבבו במערך צנטריפוגה את תמיסת התאים פעמיים למשך חמש דקות ב-425 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שפכו את העליון (supernatant) ושחזרו את משקע התאים ב-C-M-F-H-B-S-S עם FBS קר מאוד (בקרח) והניחו את הדגימות על קרח. לאחר צביעת התאים עבור חלבוני השטח הרלוונטיים.

התחילו ביצירת תרשים נקודות (dot plot) תוך ה exclusion של תאים חיוביים לצביעת תאים מתים כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, הוציאו אירועי דובלט (doublet events) כפי שמוצג כאן וכאן. כעת השתמשו בערוצי הפיזור קדימה (forward scatter) והפיזור הצידי (side scatter) כדי לבצע gating לתאי העניין, וודאו שאתם מוציאים שקיעים (debris).

לאחר מכן, צרו תרשים נקודות (dot plot) נוסף עם סינון (gating) על תאים חיוביים ל-CD 45 וחיוביים ל-IAB. בתרשים נקודות נפרד של תאים מציגי אנטיגן, צרו אזורים להבחנה בין תתי-אוכלוסיות ספציפיות של תאי DC ומקרופאגים. אזור R1 המוצג כאן לוכד תאים חיוביים ל-CD 11 C ושליליים/עמומים (dull) ל-CD 11 B.

אזור R two מגדיר את התאים בעלי רמה דומה של ביטוי על פני השטח של CD 11 C בדומה לתאים באזור R one, אך המבטאים גם CD 11 B. אזורי R three מסמנים את התאים שהם CD 11 B חיוביים ו-CD 11 C שליליים-חלשים. ניתן לנתח את שלושת האזורים הללו באופן נוסף עבור ביטוי של F four 80 ו-CD 1 0 3 כדי להבחין בין אוכלוסיות של מקרופאגים ו-DC, בהתאמה. כפי שניתן לראות בתרשים נקודות זה, תאים שהם CD 11 C חיוביים ו-CD 11 B שליליים-חלשים באזור R one יבטאו רמות גבוהות של alpha ein CD 1 0 3 ורמות נמוכות של F four 80.

תרשים נקודות זה מראה כי תאים חיוביים ל-CD 11 B וחיוביים ל-CD 11 C באזור R two יהיו מורכבים הן מתאי DCS והן ממקרופגים, בהתבסס על הביטוי הדיכוטומי שלהם של CD 1 0 3 ו-F four 80. לבסוף, בהתבסס על הפרופיל הפנוטי שלהם, החיובי ל-F four 80 והשלילי ל-CD 1 0 3, תאים ב-R three, שסוננו כחיוביים ל-CD 11 B ושליליים ל-CD 11 C, יורכבו ממקרופגים. הקשר בין משך עיכול הרקמה לבין התנובה הכוללת של התאים והביטוי של CD 11 B ו-CD 11 C מומחש בשש הדמויות הבאות. רקמת מעי שעוברה עיכול למשך שלוש דקות מניבה מספר תאים כולל נמוך, מה שמוביל למספר קטן של dcs ומקרופגים הזמינים לאפיון. עיכול רקמה למשך 11 דקות מניב תנובה גבוהה של תאים חיים, המייצרת אוכלוסיות של dcs ומקרופגים המבטאים רמות גבוהות של CD 11 B ו-CD 11 C שהן מובחנות פנוטיפית.

לעומת זאת, עיכול למשך 50 דקות מביא לתשואת תאים דומה לזו של עיכול אופטימלי. עם זאת, הפרדה של אוכלוסיות תאים שונות באמצעות CD 11 B ו-CD 11 C הופכת לקשה יותר, כיוון שהביטוי של CD 11 C פוחת ומספר התאים המתים עולה.

כך, לאחר אופטימיזציה של הפרמטרים לעיכול רקמת המעי, ניתן להגיע במהירות לתשואת תאים גבוהה. כתוצאה מכך, בידוד מהיר של תאי DC ומקרופאגים ממעי עכבר יכול להועיל להערכת התכונות הפונקציונליות של תאי מערכת החיסון עם אנטיגנים תמימיים על פני השטח.