מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה
22 במאי 2012
שינויים עדינים מעקב בהתקדמות ו קינטיקה של שלבי מחזור התא ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בשילוב של תיוג חילוף החומרים של חומצות גרעין עם BrdU ו מכתים סך הדנ"א הגנומי באמצעות יודיד Propidium. שיטה זו מונעת את הצורך של סינכרון כימי של תאים רכיבה על אופניים, ובכך למנוע את כניסתה של נזק שאינו ספציפי בדנ"א, אשר בתורו משפיע על התקדמות מחזור התא.
המטרה הכללית של הפרוצדורה הבאה היא למדוד את הקינטיקה וההתקדמות של מחזור התא. ראשית, התאים מסומנים בשיטת pulse-chase באמצעות romo, deoxy, uridine או BRDU, אשר נטמעים ב-DNA של התא במקום תימידין. לאחר מכן, התאים עוברים צביעה אימונוהיסטוכימית עם נוגדנים נגד BRDU ומנותחים באמצעות ציטומטריה זרימתית מיד לאחר הצביעה.
רק תאים בשלב S מסומנים, כאשר התאים המסומנים מתקדמים במחזור התא לשלב G2. הם מזוהים כבעלי תכולת DNA של 4N לאחר המיטוזה. תכולת ה-DNA פוחתת ל-2N. לפיכך, ניתן להשתמש בניתוח של פרופילי הפלואורסצנציה שהופקו באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את קינטיקת ההתקדמות של מחזור התא.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים אחרים המשתמשים בחומרים כימיים לסנכרון תאים הוא היעדר הפרעות פיזיולוגיות שעלולות להשפיע בטעות על מנגנון חלוקת התא. השתמשנו בשיטה זו לראשונה כאשר ניסיונותינו לחקור את קצב התקדמות מחזור התא באמצעות סנכרון כימי הניבו תוצאות בלתי צפויות שהפריעו לניתוח שלנו. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא.
למשל, מהי הבסיס לקצבי גדילה דיפרנציאליים בין סוגי תאים שונים? כדי לבחון זאת, התחילו את הפרוטוקול בסימון Pulse-Chase של התאים באמצעות BRDU. התחילו בסימון של צלחת אחת בקוטר 10 סנטימטר עבור כל נקודת זמן, בתוספת צלחת אחת עבור כל אחת מבקרות האיכות הבאות.
BRDU בלבד, PI בלבד, BRDU שלילי, PI שלילי; זריעה של כל צלחת עם 5 × 10⁵ תאי MCF-7 ב-DMEM מועשר. דגרו את הצלחות למשך 24 עד 48 שעות כדי לאפשר לתאים להתאושש ולהיצמד. לאחר שהתאים הגיעו ל-60% צפיפות (confluency), החליפו את המצע ב-DMEM טרי המכיל 10 µM.
דגרו את התאים עם BRDU למשך שעה אחת ב-37 °C ו-5% CO2 כדי לאפשר שילוב של BRDU לתוך ה-DNA. הקפידו להשאיר פלטה אחת ללא טיפול שתשמש כבקרה שלילית או כנקודת זמן אפס לאחר שעה אחת. הסירו את מצע סימון הדחף (pulse labeling medium) ושטפו את התאים קצרה ב-PBS בנקודות הזמן של שעתיים עד שמונה שעות.
הוסיפו מצע גידול טרי והחזירו אותן לאינקובטור. לאחר מכן, קצרו מיד את הצלחות של נקודות הזמן אפס ושעה אחת כפי שמתואר בסעיף הבא. כדי לקצור את התאים, שאבו את המצע ושטפו את הצלחת.
ראשית שטפו את התאים ב-PBS, ולאחר מכן הוסיפו trypsin כדי לנתק אותם מהפלטה ואספו אותם ב-DMEM. סובבו בצנטריפוגה ב-390 ×g למשך חמש דקות. השליכו את העל-נוזל. לאחר מכן שטפו את התאים ב-1-5 מיליליטר של PBS קר בקרח וסובבו בצנטריפוגה ב-390 ×g למשך חמש דקות. לאחר הסבוב, השליכו את העל-נוזל והשעיקו מחדש את התאים ב-100 µL של קרח.
PBS קר המכיל 1% FBS. ה-FBS מסייע במניעת התגבשות תאים. אחד ההיבטים החשובים ביותר בפרוצדורה זו הוא הבטחת קבלת תמיס תאים בודדים (single cell suspension) מהתאים שנאספו.
עבור עובדות. כדי להשיג זאת, ניתן להוסיף את התאים שלך ישירות לאתנול בטפטוף. זהו שלב קריטי. כדי לקבע את התאים, השתמש בפפטה כדי להוסיף את התאים בטפטוף לחמישה מיליליטר של קרח קר.
70% ethanol בתוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר. דגרו את התאים על קרח למשך 30 דקות או שמרו אותם בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. זהו שלב אידיאלי להפסקת איסוף הדגימות מנקודות הזמן השונות; ניתן להשאיר את הדגימות באתנול למשך מספר ימים, מה שמאפשר לעבד אותן בו-זמנית בשאר שלבי הפרוטוקול לצורך ביצוע צביעת BRDU ו-propidium iodide.
הוצא את התאים מהטמפרטורה של 4 °C וסבב אותם בצנטריפוגה ב-90 ×g למשך חמש דקות. לאחר הסבב, שאב את רוב המקבע והשאר כ-50 µL. לאחר מכן, בצע ערבוב בוורטקס.
כדי לשחרר את המשקע למטרת דנטורציה של ה-DNA תוך כדי ערבול בוורטקס. הוסיפו באיטיות ובטפטוף 1 mL של HCL 2N עם Triton X 100, ולאחר מכן הדגרימו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שקיעו את התאים על ידי סרטוריפוגציה של הדגימות למשך חמש דקות ב-390 $\times$g, ולאחר מכן שאבו והשליכו את העילוי.
לאחר מכן, השביהו מחדש את משקע התאים ב-1 ml של נתרב בוראט (sodium tetra borate) בריכוז 0.1 M. לאחר סבב צנטריפוגה נוסף, שאבו והשליכו את העלייה. לאחר מכן, השביהו מחדש את משקע התאים ב-75 µL של תמיסת צביעה ל-BRDU.
ערבבו ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות, תוך הגנה מאור לאחר הדגירה. השקיעו את התאים על ידי סרכוז כפי שבוצע קודם לכן, ותלו את משקע התאים במיליליטר אחד של PBS המכיל חמישה מיקרוגרם למיליליטר של propidium iodide. בעת הרצת הדגימה החיובית ל-PI בציטומטר הזרימה, צרו גרף של פיזור קדמי (forward scatter) מול פיזור צדי (side scatter) כדי לוודא את התפלגות הגודל התקינה של התאים.
שני פרמטרים אלה צריכים להיות מוצגים על סקאלה ליניארית. במקביל, צפו בגרף של FL three H לעומת FL two W כדי לבחון את צביעת ה-PI לעומת רוחב פולס הפלואורסצנציה. גרף זה משמש ליצירת gait (שער) במטרה לבודד את פלג התאים הנחשבים כנמצאים בתוך דפוס ההתפלגות הנורמלי של מחזור התא.
באופן כללי, תבנית התפלגות זו מאופיינת בשני מקבצי תאים עם תכני NDNA של שתיים וארבע בצביעת PI, המייצגים את שלבי G1 ו-G2 של מחזור התא, בהתאמה. רצף תאים הממוקם בין שני מקבצים אלו מייצג שכפול DNA מתמשך המתרחש בשלב S של מחזור התהא. צור גרף המציג את התאים שנבחרו (gated) עם FL one H או FITC בסקלה לוגריתמית בציר Y ו-PI בסקלה ליניארית בציר X.
גרף זה ישמש לקביעת הפרמטרים הנותרים באמצעות הבקרים השונים וכן לאיסוף נתונים. לצורך הניתוח, הניחו את דגימת הצביעה ב-PI בלבד בפתח הטעינה של ציטומטר הזרימה וכווננו את ההגבר (gain) כדי למקם את G1 בערך 200 על ציר ה-x. ניתן יהיה להמחיש זאת בצורה קלה יותר בגרף היסטוגרמה של צביעת ה-PI.
כעת הנח את דגימת ה-BRDU בלבד בפתח הטעינה והפעל את המכשיר. כוונן את ההגבר (gain) כך ששתי אוכלוסיות התאים, החיוביים ל-BRDU והשליליים ל-BRDU, יופיעו בגרף. באופן אידיאלי, התאים השליליים ל-BRDU ימוקמו בדיוק ב-10 to the one או מעליו.
הבקרת הסופית היא דגימה שלילית של BDU/PI. הרץ את הבקרה השלילית הזו כדי לוודא שהתאים אינם מופיעים באף אחד מהרבעים העליונים או הימניים. לאחר שפרמטרי הגרפים השונים נקבעו, ציטומטר הזרימה מכויל ומוכן לעיבוד של תאים צבועים ב-BRDU ו-PI. אסוף נתונים ממינימום של 10,000 תאים שעברו סינון (gating) לפי PI עבור כל דגימה.
לאחר מכן, באמצעות תוכנה כגון FlowJo או fax diva, צרו גרף של FITC לעומת PI, כאשר התאים נבחרים כ-PI positive מתוך גרף ה-PI לעומת FL two W. זאת כדי להבדיל את האוכלוסייה במחזור התאים. לאחר מכן, צרו שער (gate) שני כדי לבודד את האוכלוסייה החיובית ל-BRDU.
כדי לעקוב אחר מהלך הזמן של התקדמות מחזור התא, שרטטו את מספר התאים החיוביים ל-BRDU עם תכולת G1 או G2 כפונקציה של זמן, כדי להשוות את קינטיקת התקדמות מחזור התא בין שני קווי תאי סרטן המעי הגס, HT 29 ו-LS 180. תאים נאספו מדי שעה במשך שמונה שעות לאחר הסרת פולס של A-B-R-D-U.
בהשוואה של הקינטיקה בין שני הפרופילים, ניתן להבחין בהופעת שיא של שלב G1 בזמן t השווה לארבע שעות לאחר מתן BRDU בתאי LS 180, בהשוואה לנקודת הזמן המקבילה עבור שלב התאים HT 29, שבו שיא זה חסר. דבר זה מעיד על התקדמות מואצת של מחזור התא דרך שלב G2 של מחזור התא. בקו התאים של סרטן המעי הגס LS 180 כדי ליצור פרופיל מחזור של קו תאי סרטן השד.
תאי MC seven נאספו מדי שעה במשך שמונה שעות, לאחר הסרת פולס ה-BRDU. לאחר מכן, התאים שעברו סימון אימונולוגי וצביעת נגד של ה-DNA מוינו על בסיס אותות הפלואורסצנציה שלהם.
כפי שניתן לראות כאן, תאי CF seven עברו מחזור בתדירות איטית משמעותית מאשר כל אחת משתי השורות של תאי סרטן המעי הגס שנבדקו. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו סימון מטבולי של DNA, בשילוב עם קצירת תאים בנקודות זמן שונות, מאפשר לעקוב אחר קינטיקה של מחזור התא.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למעקב אחר התקדמות וקינטיקה של מחזור התא באמצעות סימון מטבולי וצביעת DNA. גישה זו מבטלת את הצורך בסנכרון כימי, ובכך מפחיתה את הסיכון לנזק לא ספציפי ל-DNA.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- ניתוח מחזור התא
- ציטומטריה בזרימה
רקע
- הבנת הדינמיקה של מחזור התא היא חיונית למגוון מחקרים ביולוגיים.
- שיטות מסורתיות עלולות להוות ארטיפקטים עקב סנכרון.
- סימון מטבולי מספק ייצוג מדויק יותר של שלבי מחזור התא.
- ציטומטריה זורמת מאפשרת ניתוח מדויק של תאים מסומנים.
מטרת המחקר
- למדידת קינטיקת התקדמות מחזור התא.
- שימוש בסימון BrdU למעקב אחר סינתזת DNA.
- ניתוח של שלבי מחזור התא ללא סנכרון כימי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סימון מסוג Pulse-chase באמצעות BrdU או נוקליאוזידים אחרים.
- צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות נוגדנים נגד BrdU.
- ניתוח תאי הצביעה באמצעות ציטומטריה של זרימה.
- גילוי תכולת ה-DNA לזיהוי שלבי מחזור התא.
תוצאות עיקריות
- תאים בשלב S מסומנים ביעילות באמצעות BrdU.
- ציטומטריית זרימה חושפת שינויים בתוכן ה-DNA ככל שהתאים מתקדמים במחזור.
- השיטה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר קינטיקת מחזור התא.
- נזק לא ספציפי ל-DNA ממוזער, דבר המשפר את מהימנות הנתונים.
מסקנות
- השילוב של סימון מטבולי וציטומטריה של זרימה יעיל לחקר דינמיקת מחזור התא.
- גישה זו מספקת תובנות על התקדמות מחזור התא ללא החסרונות של סנכרון כימי.
- יישומים נוספים של שיטה זו עשויים לשפר את הבנתנו את הביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
מדידה מדויקת של קינטיקת התקדמות מחזור התא היא קריטית להפחתת סיכונים בשלבי תיקוף מוקדמים של יעדי אונקולוגיה ולאופטימיזציה של סריקת תרכובות במודלים של מחלות פרוליפרטיביות. סימון מטבולי בשילוב עם ציטומטריה זרימה מאפשרים הערכה כמותית, נטולת ארטיפקטים, של דינמיקת מחזור התא, ובכך תומכים בביטחון ניבוי בחקירת מסלולים ובמחקרים מכניסטיים. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי אספקת נתונים חסונים וניתנים לשחזור על פרוליפרציה של תאים ותגובה לתרופות, ללא ארטיפקטים של סנכרון המבלבלים את התוצאות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מדידה ישירה של קינטיקת מחזור התא כדי להבהיר את תפקוד המסלול ואת המעורבות של היעד.
- מפחית עמימות מנגונית על ידי הימנעות מארטיפקטים של סנכרון כימי או מכני.
- תומך בביטחון חיזוי בהערכת שיעורי גדילה דיפרנציאליים בין קווי תאים שונים.
- מסייע בתיקוף תפקודי של יעדים רגולטוריים של מחזור התא במחקר אונקולוגי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק קריאות כמותיות וסטנדרטיות להתבצעות ולהתפלגות של שלבי מחזור התא.
- משפר את השחזוריות של הבדיקה על ידי מזעור הפרעות פיזיולוגיות במהלך הכנת הדגימות.
- מאפשר סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של השפעות תרכובות על קינטיקת מחזור התא במודלים הרלוונטיים למחלה.
- תומך בזרימות עבודה (workflows) ניתנות להרחבה ומוכנות לפלטפורמה לצורך הערכת תרכובות ומיון מובילים (lead triage).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים בין מדידות קינטיקה של מחזור התא לנקודות קצה של שגשוג (proliferation) הרלוונטיות למחלה.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מעקב אחר השפעות התרופה על התקדמות מחזור התא.
- תומך בקבלת החלטות על קידום הפיתוח בהתאם לסיכון, על בסיס נתונים כמותיים של מחזור התא הספציפיים לשלב.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטית במודלים של אונקולוגיה תרגומית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו של סימון מטבולי וציטומטריה של זרימה משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, והיא תומכת הן בבדיקת היפותזות ראשונית והן באפיון תרכובות בשלבים מאוחרים יותר.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את התקדמות מחזור התא כדי להבהיר את פעילות המסלול ולתקף מטרות.
- סריקה: מספק פלטיים כמותיים הניתנים לשחזור עבור סריקת תרכובות ופיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מספק נתוני מהלכים של זמן ברזולוציה גבוהה על מעברי שלבי מחזור התא לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין קינטיקה של מחזור התא in vitro לבין נקודות סיום של תגובה לתרופות ופרוליפרציה הרלוונטית למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה סטנדרטית עם מעט ארטיפקטים, הניתנת להתאמה בין קווי תאים ומודלים של מחלות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי מחזור התא.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות מחזור התא.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ויעילות הון על ידי אספקת נתונים קינטיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום תוכניות למחלות אונקולוגיות ומחלות פרוליפרטיביות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של ציטומטריה זרימתית וצביעה אימונוהיסטוכימית.
- נדרשת גישה למכשור ציטומטריה זרימתית ולתוכנה אנליטית.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים של פרוטוקולי סימון ו-gating.
- ניתן להתאמה לקווי תאים שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מודלים ספציפיים.
- הכנת הדגימות ודיוק ה-gating הם קריטיים למדידות קינטיות מהימנות.
