טומוגרפיה ממוחשבת מונחה תחום בזמן מפוזר טומוגרפיה זוהר על בעלי חיים קטנים על לוקליזציה של סמנים לסרטן

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפיק תמונות פלואורסצנציה של ביטוי קולטן הגורם לשאיבה של גדילה אפיתלית (EGFR) במודל עכבר של גליומה אורטוטופית. זאת מושג על ידי הזרקת תאי גליומה אנושיים מסוג U2 51 המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק להמיספירה המוחית השמאלית של עכבר A IIC. לאחר שהגידול גדל במשך שבועיים, מוזרק לעכבר תערובת של שני סמני פלואורסצנציה.

לאחר מכן, העכבר נסרק במערכת רנטגן לבעלי חיים קטנים כדי לאסוף נתונים אנטומיים הנחוצים לשחזור תמונה מדויק. הנתונים משמשים למיקום אנטומי של המקור ושל מיקומי הגילוי של מערכת הטומוגרפיה האופטית, ותוכנה מותאמת אישית משמשת לאיסוף נתוני הפלואורסצנציה ולבניית התמונה הסופית. בסופו של דבר, שיטה זו יכולה לבנות תמונה של גידול המבוססת על ביטוי יתר של epidermal growth factor באמצעות דימות פלואורסצנציה ורנטגן, שאת דיוקה ניתן להשוות לדימות תהודה מגנטית (MRI) עם חומר ניגוד.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טומוגרפיה פלואורסצנטית לבעלי חיים קטנים המבוססת על התקני CCD (charge couple device), הוא שגילוי באמצעות ספירת פוטונים בודדים בעזרת שפופרות הכפלת פוטונים (photo multiplier tubes) מציע רגישות גבוהה בהרבה וטווח דינמי רחב יותר לגילוי אור. שיטה זו יכולה לשמש בסופו של דבר לניטור ולהערכת הצלחתן של תרפיהות מולקולריות על ידי מדידת הביטוי של מטרותיהן. בעוד שגידולים תת-עוריים מצולמים בקלות בשיטות לא טומוגרפיות המשתמשות בדימות שטח, מערכת זו תוכננה לבצע דימות דרך רקמה בעובי של מספר סנטימטרים, מה שהופך אותה למתאימה במיוחד לדימות של הובלת חומרי ניגוד ודליפתם אל תוך גידולי מוח.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביטוי של סממנים ביולוגיים לסרטן, ניתן ליישמה גם במחקרים אחרים של מחלות כגון זיהום, השמנה, או גורמי הזדקנות כגון מחלת אלצהיימר. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו ביישומה בשל אופי התפזורת של התפשטות האור ברקמה ביולוגית והקושי בשימוש בטומוגרפיית רנטגן לצורך שחזור האור המפוזר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית.

מכיוון ששלבי איסוף הנתונים ושחזור התמונה עשויים להיות קשים ללמידה, חשוב לוודא שהנתונים שנאספו מהמערכת הפלואורסצנטית מכויילים היטב. חבילת התוכנה near fast תוכננה לקרוא נתונים אופטיים ולהשתמש בתמונות טומוגרפיה של קרני X כדי ליצור רשת של אלמנטים סופיים, המשמשת כתבנית מרחבית לשחזור הפלואורסצנציה. ראשית, הנח עכבר עירום אתמי (athymic nude mouse) מורדם על סדין ניתוח סטרילי, ואשר את עומק ההרדמה לפני המשך הפעולה; נקה וחטא את העור מעל אזור החתך.

השתמשו ב-Betadine כדי להניח סדין כירורגי סטרילי מעל אתר החתך. בעזרת סקלפל, בצעו חתך קטן מעט משמאל לקו האמצע ו-0.5 סנטימטרים מאחורי הקו האינטראוקולרי. נקו את פני הגולגולת על ידי הסרת כל רקמה חיבורית כדי שניתן יהיה לזהות את נקודות הייחוס. לאחר חשיפת הגולגולת, השתמשו במקדח במהירות גבוהה עם מקדח סטרילי של מילימטר אחד כדי ליצור חור שנמצא שני מילימטרים משמאל לקו המרכזי ושני מילימטרים מאחורי ה-bgma.

מלא מזרק Hamilton Micros עם מחט בעלת קצה קהה בכיול 27 בתאים המיועדים להשתלה. לאחר מכן, הנח את העכבר על מסגרת סטריאוטקסית. לאחר מכן, וודא שהעכבר נמצא במישור הרדמה כירורגי ואסתטי עמוק באמצעות לחיצה על בהונו, והחזר את כיסוי הניתוח על גבי בעל החיים.

כעת, קבעו את המזרק הטעון על גבי המסגרת הסטריאוקסית. מקמו את המזרק מעל החור בגולגולת והחדירו את קצה המחט ל-3 mm מתחת לפני השטח של הגולגולת. לאחר מכן, משכו את המחט חזרה ב-1 mm כדי ליצור כיס.

השלב הבא הוא הזרקה איטית של התאים לחצי הכדור המוחהי השמאלי לאורך תקופה של חמש דקות. עם סיום ההזרקה, יש להוציא את המחט ולנקות את החור באמצעות Betadine. כדי למנוע מהתאים לגדול מחוץ לאתר ההזרקה, יש להוציא את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית ולמלא את החור החשוף בשעוות עצם שחוממה מראש.

לבסוף, סגרו את אתר החתך באמצעות תפר ניילון סטרילי 5-0. החזירו את העכבר לכלוב מחומם ועקבו אחריו עד להחלמתו; לאחר ההחלמה, הזריקו לעכבר 130 µL של buprenorphine בריכוז 0.1 mg/kg בדרך תוך-peritoneal (IP) ואפשרו לגידול לגדול במשך 14 ימים לפני הדמיה. ביום הדמיית העכבר, הפעילו את המערכת כדי לאפשר ללייזרים ולגלאי האור להתחמם למשך כ-20 דקות.

כדי למנוע סטיות ורגישות של המערכת, מקם מפזר קו הנדסי (engineered line diffuser) בגודל 100 מעלות על ארבע מעלות במרכז המדויק של מסגרת הדמיה (imaging gantry), כדי לפזר את לייזר ההעברה בין ערוצי הגילוי של המערכת בעצימות שווה. כוונן את זווית המפזר ידנית כדי למקסם את כמות האות המזוהה על ידי כל חמישה ערוצי איסוף האור. לאחר מכן, מקם צפיפות אופטית.

שני מסנני צפיפות ניטרלית ממוקמים לפני כל פוטו-מכפיל (PMT) לגילוי פלואורסצנציה וצפיפות אופטית. מסנן צפיפות ניטרלית אחד ממוקם לפני כל גילוי נفاרות. ה-PMTs אוספים 100 פונקציות פיזור פולס זמניות או T psfs של הלייזר, כאשר לכל אחת מהן זמן אינטגרציה של שנייה אחת עבור כל לייזר באופן סדרתי; נרמלת כל TPSF לפי ייחוס הלייזר, מתוקנים עבור סחיפה זמנית בייחוס הלייזר, ומבצעים ממוצע על פני כל החזרות עבור כל גלאי ועבור כל לייזר בנפרד.

ערכי TPS ממוצעים אלו הם פונקציות התגובה של המכשיר הספציפי לגלאי, המשמשות לשחזור התמונה האופטית 12 שעות לפני הליך ההדמיה. מזריקים לעכבר הניסוי תערובת של סמנים פלואורסצנטיים. כיול מדויק של מערכת הטומוגרפיה הפלואורסצנטית והגבלת תנועת בעל החיים הם ההיבטים המורכבים ביותר של הליך זה.

שחזור הדימות הוא בעיה בעלת הגדרה לקויה (ill-posed) באופן כזה, שגם שגיאות קלות באיסוף הנתונים עלולות להוביל לשגיאות משמעותיות בתמונה המשוחזרת. כדי להבטיח איסוף נתונים מדויק, אנו מקבעים את העכבר בצורה הטובה ביותר וחוזרים על הכיול לפני ואחרי הסריקה כדי להגדיל את הסיכוי לקבל כיול מדויק. כאשר החיה מוכנה, הנח את בעל החיים המורדמ על תומכי הפיברגלס של מיטת הדימות.

לאחר מיקום הראש בתוך קונוס האף להרדמה רציפה בגז, קבעו את השיניים על סרגל הנשיכה והדביקו את בעל החיים בעזרת סרט הדבקה. יש למקם את העכבר במרכז המקורב של מסגרת הדמיה (gantry). ניתן להנחות מיקום זה על ידי סיבוב לייזר העירור ב-180 מעלות סביב העכבר, כדי להבטיח שנקודת המוקד של הלייזר מאירה נקודה הנמצאת בקירוב במרכז העכבר מנקודת מבטו של הלייזר בכל הזוויות.

לאחר המיקום הנכון, העבר בזהירות את מיטת הדימות ואת העכבר לסורק ה-micro CT ואסוף מידע אנטומי ברזולוציה של 93 micrometers isotropic עבור כל ראשו של העכבר. בחן את מחזור תמונות ה-CT ובחר את הפרוסות שידוממו באמצעות מערכת הטומוגרפיה הפלואורסצנטית. העבר בזהירות את מיטת הדימות ואת העכבר בחזרה למערכת הטומוגרפיה הפלואורסצנטית.

בחרו את מספר מיקומי המקור עבור כל פרוסה של הדמיה, את זמן האינטגרציה עבור כל מדידת TPSF, את מספר החזרות עבור כל מיקום מקור, ואת המיקום ומספר פרוסות ההדמיה הרצויות מתוך ערימת תמונות ה-CT שנוצרה קודם לכן. לאחר מכן, הניחו מסננים לפני ה-PMTs של גילוי הפלואורסצנציה כדי לחסום את כל אור העירור, ומסנני צפיפות אופטית (neutral density filters) לפני ה-PMTs של גילוי הנחירה. כדי למנוע רוויה של גלאים אלו, הפעילו את תוכנת רכישת הנתונים לאיסוף t psfs של פלואורסצנציה ונחירה בכל מיקום מקור-גלאה שהוגדר, בשתי אורכי גל העירור.

עבור כל סט של psfs של T שנאספו, נטר ורשום את עוצמת הלייזר באמצעות ערוץ PMT ייחוס. קבע את פני השטח החיצוניים של העכבר ואת מיקומו של מיטת הדימות. תמוך במוטות מתוך תמונות ה-CT וצור מסכות המכסות את גבולות העכבר ומוט הדימות.

בנפרד, השתמשו במסכת העכבר כדי להפיק רשת אלמנטים סופיים של בעל החיים באמצעות התוכנה near fast. מקמו את מיקומי המקור והגלאים ממערכת הטומוגרפיה הפלואורסצנטית על פני השטח של הרשת, בהתבסס על קואורדינטות רישום מרחבי של micro CT ופלואורסצנציה. הסירו נקודות נתונים אופטיות הקשורות למיקומי מקור או גלאים שבאים במגע עם מיקום מיטת הדימיון.

מוטות תמיכה מנרמלים את הנתונים שנאספו בכל מיקום של גלאי המקור באמצעות ייחוס הלייזר, מתקנים עבור סחף זמני בייחוס הלייזר ומתקנים עבור רגישויות המסננים, אשר נקבעו בבדיקות ניסיוניות בעת הרכישה. חשבו את יחס Born של הנתונים עבור כל מיקום של גלאי המקור והכפילו בסימולציית מודל קדימה של נבדירה (transmittance) המבוססת על רשת אלמנטים סופיים של בעל חיים עבור תכונות אופטיות אחידות. הדבר נעשה כדי להפחית שגיאות הקשורות לצימוד של המקור או הגלאי לרקמה, כדי לכלב את הנתונים למודל ולהתאים את הנתונים להיבטים אחרים של חוסר התאמה בין נתוני המודל לנתונים הנמדדים. בנו לבקטור נתונים המורכב מההפרש המנורמל של נתוני יחס Born שנאספו בשני אורכי הגל.

גורם קנה המידה נבחר כדי למקסם את ניגודיות הקשירה של EGFR, בצעו שחזור תמונה במישור הזמן עם נתוני ההפרש המכוילים תוך שימוש ב-TPSF עבור כל ערוץ גילוי כקלט, וצרו מפות פלואורסצנציה של העקב המכוון עם הניגודיות המוגברת שנראה. להלן דוגמה לשחזור פלואורסצנציה המוצמד לתמונה אנטומית של CT שרושמה עבור עכבר עם גידול גליאומה אורתוטופי מסוג U2 51. מרכז המסה של הגליאומה שנקבע על ידי שחזור הפלואורסצנציה היה במרחק של מילימטר אחד ממרכז המסה של הגידול, כפי שנקבע באמצעות דימות תהודה מגנטית עם ניגודיות מוגברת.

התוכנה לרכישת הנתונים נבנתה במיוחד עבור מכשיר זה, אך ניתן לבצע את מרבית טכניקות עיבוד התמונה באמצעות תוכנת near fasts הזמינה בכתובת nearfasts.org@. לכן, בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שגם המערכת וגם הנתונים כוילו במדויק לפני שחזור התמונה. כיול זה מחייב התחשבות ברגישות ובהבדלים הזמניים בין הגלאים, לאחר שחזור התמונה של רכיב עקיבה המכוון לסמן ביולוגי.

דימוי דומה של סמן שאינו ממוקד מספק אמצעי לתיקון של ספיגה שאינה מתווכת בקולטן. דבר זה מאפשר לכמת את כמות קשירת הסמן וכן את צפיפות הקולטנים in vivo לאחר פיתוחו. טכניקה זו נתנה השראה לחוקרים אחרים לעצב מערכות של טומוגרפיה פלואורסצנטית המודרכת על ידי דימוי רנטגן, וסללה את הדרך לדימוי של הגוף כולו בבעלי חיים גדולים יותר.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן ביצוע ניסוי של טומוגרפיה פלואורסצנטית דיפוזית, המשולב עם מערכות דימות אנטומי בקרני X ודימות אופטי לצורך דימות של סממנים ביולוגיים לסרטן.