בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS
1 בנובמבר 2007
בידוד של לימפוציטים באמצעות MACS Miltenyi ערכת מהווה דרך אמינה לטהר תאים שלמים homogenates רקמת הלימפה. תאים מטוהרים באמצעות מערכת Miltenyi הם בדרך כלל ≥ 96% טהור. הנה, אנחנו מדגימים את הצעדים שננקטו כדי לבודד תאים מסוג CD4 + T, אחת ערכות רבים המוצעים על ידי Miltenyi.
זהו מגנט Max MIDI. כתוב עליו,זהירות שדות מגנטיים חזקים ביותר. שלום, אני מלאני מתיו מהמעבדה של מייק קולינס באוניברסיטת קליפורניה אירביין, המחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה.
היום נדגים הכנה של תאי T חיוביים ל-CD4 באמצעות סלקציה שלילית, תוך שימוש בערכות של Milton Biotechnology. כאן לפנינו ה-minimax וה-minimax magnets; ה-minimax משמש להפרדות גדולות יותר. ניתן להעביר עד 10⁹ תאים דרך עמודה המתאימה ל-minimax, בעוד שה-minimax magnets משמשים לנפחים קטנים בהרבה של תאים.
לפיכך, בהתאם לשאלה אם אתם מבצעים הפרדה חיובית או שלילית, תסמנו את התאים באמצעות הנוגדן המתאים. על הנוגדים ישנם חלקיקים מגנטיים שייקשרו למגנט. במקרה של ברירה שלילית, התאים שאתם מעוניינים בהם יעברו דרך העמודה ותוכלו לאסוף את תמיסת השטיפה (eluent), שתכיל את התאים המבוקשים.
עליי לציין שהטכניקות שאני מציג לכם הלילה אינן סטריליות. לכן, אם ברצונכם להשתמש בתאים אלו לתרבית תאים, עליכם לבצע הכל במכסה של תרביות רקמה עם מכשירים סטריליים. כך שעל אף שאני מציג לכם הכנה של תאי T חיוביים ל-CD4, רבות מהטכניקות הללו ישימות לטיהור של סוגי תאים אחרים באמצעות ערכות הביוטכנולוגיה של Miltenyi.
בשלב זה, הסרתי את קשרי הלימפה מהעכבר, ואני מדגים לכם כיצד לעשות זאת בפירוט בגיליון שבעה של JoVE: הכנת קשרי לימפה עבור דימות בדו-פוטון. כעת אני הולך ל nghiס את קשרי הלימפה לתליה של תאים בודדים בתוך מסננת תאים של 70 מיקרון. כעת א nghiס את קשרי הלימפה לתליה של תאים בודדים באמצעות גב של מזרק בנפח 6 מיליליטר.
הקשריים הלימפטיים נמצאים ב-RPMI בתוך מסנן, וחשוב להכין תרחיף תאים בודדים תקין. הסיבה לכך שאנו מבצעים זאת במסנן היא כדי לוודא שלא נשארים גושי תאים. לאחר שאסיים את הריסוק, אוציא את המסנן מהמדיום ואשתמש בכל מה שעבר דרך המסננת כדי לקבל את תרחיף התאים הבודדים.
בזמן הטחינה, עליכם לוודא שאתם מפרקים את כל הרקמה ככל האפשר. מתלים של תאים בודדים אלו הם המקור ממנו נטהר את תאי ה-T החיוביים ל-CD4. אוקיי, כעת סיימתי לטחון את הרקמה וניתן לראות שרוב קשרי הלימפה כמעט ונעלמו.
נותרו לנו כאן כמה חלקי שומן קטנים וסוג של קליפה של קשרי לימפה עם מעט רקמה חיבורית, שכולם נצמדו יחד מששת קשרי הלימפה. וכעת אני מסיר את מסנן התאים. ניתן לראות כאן שהמדיום עכור מאוד.
הוא מלא בתאים מתרחיף תאים בודדים כדי להבטיח שנקבל מספר מקסימלי של תאים מהמסנן, שכן חלקם יידבקו אליו. אני שוטפת זאת עם מספר מיליליטרים של מצע גידול, ולאחר מכן מעבירה בפיפטת את כל המצע לשפופרת פלקון של 15 ml ומסובבת אותה בצנטריפוגה כדי לשקע את התאים לצורך טיהור מאוחר יותר. הנה תרחיף התאים הבודדים שלי, לאחר סבב בצנטריפוגה ושקיעה ב-300 G למשך 10 דקות.
אם אתם מעריכים כי יהיה לכם מספר גבוה של תאים מתים בסספנסיות התאים הבודדים, מומלץ להשתמש בערכה להסרת תאים מתים מבית Miltenyi Biotec. כעת, לאחר שהשקעתי את התאים, אשפוך את המדיום ואבצע ליזיס של תאי דם אדומים, ולאחר מכן אספור את התאים ואבצע על תאים אלו סלקציה שלילית של תאי T מסוג CD4 positive. אוקיי, כעת אבצע ליזיס של תאי דם אדומים (RBC lysis).
אנו הולכים להמיס את כדוריות הדם האדומות ששקענו יחד עם הלימפוציטים על ידי הפחתת האוסמולריות של התמיסה, תחילה על ידי הוספת מים ולאחר מכן החזרתה לרמת תמיסת 1X באמצעות הוספת 10X-D-B-P-S. הלימפוציטים שלנו עמידים יותר לשינוי באוסמולריות מאשר כדוריות דם אדומות, אך עדיין עלינו לעבוד במהירות כדי לא לגרום להמסה של הלימפוציטים, דבר שאנו מעוניינים למנוע. חלק מהעבודה המהירה הוא מילוי הנפחים הדרושים להמסה לפני הוספת המים למערכת.
אני רוצה להיות מסוגל להוסיף את ה-10 X-D-B-P-S-A מספר שניות לאחר הוספת המים, כדי לוודא שאני לא גורם לליזיס של הלימפוציטים, אך כן גורם לליזיס של תאי הדם האדומים. לכן, אני לוקח 900 µL של מים (כמעט מילליליטר אחד) ו-100 µL של 10 X-D-B-P-S.
שתי השפופרות שלי מוכנות. בשלב הליזיס, אני מוסיף את המים, ממתין מספר שניות, אולי מנער מעט את השפופרת ואז מוסיף את ה-10 X-D-B-P-S ומנער את השפופרת מעט יותר. ואם אתם מבצעים ליזיס לכמות גדולה של תאי דם אדומים, תראו שנוצר מעין גוש אמורפי גדול מכל ממברנות התאים שנשברו.
יש לנו כאן כמות קטנה, וניתן לראות שמדובר במעט ממברנות תאים שבורות. לכן, לאחר ביצוע הליזיס, למקרה שהייתה טעות בפיפטינג, אני נוהג להוסיף מספר מיליליטרים של מדיום לתאים כדי להבטיח שהאוסמולריות נכונה ושלא יימשך תהליך הליזיס. אוקיי, כעת יש לי את הלימפוציטים בסuspended תאים בודדים.
שוב, ביצעתי את הליסיס של תאי הדם האדומים וכעת אני הולכת לסבב אותם במ centri-fuge כדי להשקיע אותם. לפני שאעשה זאת, אני אספור אותם באמצעות hemo cytometer כדי לקבוע כמה נוגדנים עלינו להוסיף עבור ערכת הבחירה השלילית (negative selection) של תאי T חיוביים ל-CD4. אוקיי, כעת אני מסובבת את התאים ב-max buffer וניתן לראות שהמשקוב לבן הרבה יותר לאחר ביצוע הליסיס של ה-RBC.
כעת אבצע ברירה שלילית עבור תאי T חיוביים ל-CD4. לכן, אשפוך את כל המצע, את כל תחביב ה-max שבו שקעתי את התאים. לאחר מכן, אסמן אותם באמצעות תערובת הנוגדנים עם הביוטין, שזהו השלב הראשון בברירה השלילית של תאי T חיוביים ל-CD4.
לאחר מכן אני מדגרי במקרר למשך 10 דקות. אוקיי, התאים שלי סיימו את הדגירה הראשונית שלהם. כעת אני אוסיף את האנטיביוטיקה למיקרובידס (microbeads) ואחזיר אותם למקרר למשך 15 דקות.
עבור הפרדת תאים ספציפית זו, נשתמש בעמודת LS מבית Miltenyi Biotec. מה שנעשה הוא להניח אותה על המחזיק המגנטי ולהכין את העמודה על ידי העברת 3 mL של max buffer דרכה. נפתח את העמודה ונמקם אותה כך שהשיניים פונות פנימה אל המגנט. כעת אוסיף את ה-max buffer לעמודה, ותראו אותו יורד בעמודת ה-LS ומתחיל לטפטף למטה. אין צורך לחשוש מכך שהעמודה תתייבש.
מתח הפנים של הנוזל ימנע ממנו להתייבש עד להוספת התאים. לפני הוספת התאים, חשוב להמתין עד שהבופר max יסונן לחלוטין דרך העמודה. כעת, לאחר דגירה של 15 דקות עם חרוזי biotin מגנטיים שהוצמדו לתאים ובבופר max, אני אשפוך את הבופר ואשחזר את התאים בכמות בופר המתאימה למספר התאים שלנו.
לכן תצטרכו לבדוק את פרוטוקול ה-milli tiny עבור זאת. וכעת אני אעביר אותם לעמודה ששטפנו כעת ב-max buffer. עכשיו נוסיף את תרחיף התאים לעמודה.
ומכיוון שזוהי עמודת ברירה שלילית, אנו נאסוף את התאים שעברו דרכה, ובמקרה זה, כולם אמורים להיות תאי T חיוביים ל-CD4. כעת אשטוף את העמודה עם 12 ml של max buffer, ושוב, נאסוף את השטיפה, שאמורה להכיל רק תאי T חיוביים ל-CD4. כעת אסבוב במרכז fugה את תאי ה-T החיוביים ל-CD4, אשחזר אותם, ולאחר מכן אסמן אותם בצבע המתאים שאשתמש בו לצורך הדמיית tau.
אני גם אקח מדגם קטן של התאים שפינקתי ואסמן אותם עם anti CD3 ו-anti CD4, ואעביר אותם ב-FACS כדי לוודא שיש לי אוכלוסייה נקייה של תאי T חיוביים ל-CD4. הנה מבט על התאים שסובבנו כעת. זו אמורה להיות אוכלוסייה טהורה של תאי T חיוביים ל-CD3 ו-CD4.
כך הצגתי בפניכם את תהליך הברירה השלילית של תאי T חיוביים ל-CD4. באמצעות ערכת ה-Milit tiny biotech, נבצע העברה אדופטיבית של תאים אלו לעכבר ונשתמש בו עבור אחד מניסויי ה-T Photon and machine שלנו. בהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את בידודם של תאי CD4+ T באמצעות ערכת Miltenyi MACs, שיטה מהימנה לטיהור לימפוציטים מהומוגנאטים של רקמות לימפואידיות שלמות. התהליך מניב תאים שהם בדרך כלל בדרגת טוהר של ≥ 96%.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
- טכניקות לטיהור תאים
רקע
- בידוד לימפוקיטים הוא קריטי למחקרים אימונולוגיים שונים.
- ערכת Miltenyi MACs נמצאת בשימוש נרחב בשל יעילותה ואמינותה.
- תאי CD4+ T ממלאים תפקיד משמעותי בתגובה החיסונית.
- רמות טהרה גבוהות הן חיוניות ליישומים המשכיים.
מטרת המחקר
- להדגמת שיטת סלקציה שלילית לבידוד תאי CD4+ T.
- להדגשת היעילות של ערכת Miltenyi MACs.
- לספק מדריך שלב-אחר-שלב עבור חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במגנטים מסוג Max MIDI להפרדת תאים.
- טכניקה להכנת ברירה שלילית.
- יישום של ערכות Miltenyi biotechnology.
- עיבוד של נפחים גדולים של תאים באמצעות עמודות ייעודיות.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי CD4+ T ברמת טוהר גבוהה.
- הדגמה של יעילות ערכת Miltenyi MACs.
- אספקת פרוטוקול מהימן עבור חוקרים.
- הדגמה של השימוש במגנטים להפרדה של תאים.
מסקנות
- ערכת Miltenyi MACs היא כלי יעיל לבידוד לימפוציטים.
- רמות טוהר גבוהות של תאים מבודדים משפרות את תוצאות הניסוי.
- ניתן ליישם שיטה זו במסגרות מחקר אימונולוגיות מגוונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
בידוד של תאי CD4+ T בדרגת טוהר גבוהה מקשרי לימפה של עכברים מאפשר ביצוע מהימן של בדיקות אימונולוגיות המשך ומחקרי העברה אדופטיבית. פרוטוקול סלקציה שלילית זה, המשתמש בטכנולוגיית Miltenyi MACS, תומך בתיקוף של מטרות ובסריקה פנוטיפית על ידי אספקת תאי T פונקציונליים שלא עברו מגע (untouched) בדרגת טוהר של ≥96%. שיטה זו מפחיתה את השונות הניסויית ומגבירה את הביטחון החזוי במחקרים של אימונולוגיה פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקוד תאי T מסוג CD4+ לצורך בדיקת היפותזות טיפוליות והבהרת מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מספק תאי T מסוג CD4+ נאיביים (naïve) שלא עברו מניפולציה, לצורך הערכת מעורבות המטרה ללא ארטיפקטים של הפעלה.
- ערך חיזוי: בידוד ברמת טוהרה גבוהה תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות אימונומודולטוריות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות ותוקפות עבור בדיקות תפקודיות ופרופיליל cytokines המשכיים.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות שמירה על טוהר התאים וחיוניותם באופן עקבי.
- יכולת הרחבה (Scalability): תאימות לעמודות LS לעיבוד מספרים גדולים של תאים, התומכת בסינון בעוצמה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות רלוונטיות למחלה על ידי אספקת תאי CD4+ T ראשוניים מעכבר לצורך העברה אדופטיבית.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות הכנת תאים סטנדרטית.
- הפחתת סיכונים: מחזק את הביטחון החזוי בתוצאות הדימות והמדידות הפונקציונליות על ידי מזעור סוגי תאים מזוהמים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow Integration)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מטרות מוקדם ועד למחקרי דימוי פרה-קליניים, במיוחד כאשר היא מקושרת לזרימות עבודה של כריתת קשרי לימפה ודימוי ב-2-פוטונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד תאי CD4+ T פונקציונליים למחקרי מנגנון.
- סינון (Screening): מספק תאים המוכנים לבדיקה עם פלטים כמותיים לצורך תיקוף בציטומטריה של זרימה ומדידות תפקודיות.
- אנליטיקה: מאפשר הערכת טוהר לאחר בידוד באמצעות FACS באמצעות צביעת CD3/CD4, ובכך תומך בקבלת החלטות מבוססות נתונים (go/no-go).
- מחקר תרגומי: מקשר לדמיון פרה-קליני באמצעות העברה אדופטיבית של תאי T מבודדים למעקב in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לבידוד לימפוציטים לשימוש חוזר, הישימה בפרויקטים של אימונולוגיה ואימונו-אונקולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי, תיקוף מטרה, הפחתת עמימות מכניסטית במסלולים המתווכים על ידי תאי T.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של בידוד תאים ראשוניים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת של המשך או עצירה (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בפיתוח אימונומודולטורים.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף וקבלת החלטות על קידום מודגשים בסיכון, המבוססים על נתונים מהימנים של מעורבות המטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בעיבוד רקמות ראשוניות ובטכניקות הפרדת תאים מבוססות חרוזי מגנט.
- תלוי בעמודי Miltenyi LS, במחזיקים מגנטיים ובמערכות בופר מתאימות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך ספירת תאים עקבית, הערכת חיוניות ותיקוף FACS.
- שיקולי התאמה כוללים ביצוע סטרילי לעומת ביצוע לא סטרילי בהתאם לשימוש הסופי (למשל, תרבית תאים לעומת העברה אדופטיבית).
- מגבלות מעשיות כוללות לחץ תאי פוטנציאלי במהלך שלבי הגריסה והליזיס, דבר המחייב טיפול עדין לשמירה על החיוניות.
