בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון ביטוי גנים באמצעות מנגנוני גרעין תפקודיים שהופקו מתאים. זאת מושג תחילה על ידי קציר והנפחה של תאי hela. לאחר מכן, התאים מולבשים על ידי השקעה, ובשלב השלישי סובבים בצנטריפוגה כדי להשקיע את הגרעינים.

הגרעינים עוברים מיצוי במלח, ריכוז ודיאליזה במטרה להשיג מנגנוני ביטוי גנתי מסיסים ופונקציונליים. בסופו של דבר, ניתן להעריך את התפקוד של התמציות הגרעיניות על בסיס פעילויות השעתוק והשחור שלהן, כפי שניתן לבחון באמצעות מערכת המשלבת RNA polymerase לשעתוק ושחור. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הכנת תמצית גרעינית בכמויות גדולות (bulk), הוא שבאמצעות טכניקה זו ניתן להשתמש בכמות קטנה של תאים להכנת התמצית הגרעינית.

התחילו בזריעת תאי hela בשלוש צלחות של 150 מילימטר עם מצע DMEM מועשר ב-FBS ואנטיביוטיקה. גדלו את התרביות באינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius עם 5%CO2 עד שהתאים יגיעו ל-90%Co fluency. בשלב זה, שאבו את המצע מתרביות תאי ה-HELOC ושטפו אותם פעם אחת עם 13 מיליליטר של PBS בטמפרטורת החדר לכל צלחת, ולאחר מכן שאבו. הניחו כל צלחת על צדה למשך מספר שניות ושאבו את שאריות ה-PBS.

בשלב הבא, השתמשו במגבב תאים (cell lifter) כדי לגרד את התאים לשולי התחתונים של כל צלחת, ולאחר מכן העבירו את התאים למבחנה מסוג einor בנפח 1.5 מיליליטר. לבסוף, השקיעו את התאים במיקרו-צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-100$\times$g ובטמפרטורה של 4°C. כעת, שאבו את ה-PBS מהמשקע של התאים והעריכו את נפח התאים הדחוס, ה-PCV, על ידי התבוננות בסימוני המדידה שעל המבחנה.

לאחר מכן, יש להוסיף למשקע התאים נפח של בופר היפוטוני הגדול פי שניים מערך ה-PCV. נער את המבחנה בעדינות כדי לסספנד את התאים. יש להעביר את תגית התאים בעדינות למעלה ולמטה באמצעות פיפט של 1000 microliter כדי לפרק צבירי תאים במידת הצורך.

לאחר מכן, השקיעו את התאים בתנאי סרכזוגה זהים לאלו של השלב הקודם. לאחר הסרכזוגה, שאבו בזהירות את שכבת הבאפר ההיפוטוני. התאים יתחילו להתנפח ונפח התאים יעלה לכ-750 עד 1000 microliters.

הוסיפו באפר היפוטוני חדש לנפח סופי של 1.5 milliliters ותלו את התאים בתוך הבאפר. לבסוף, דגרו את התאים הנפוחים והמתלוים על קרח למשך 10 דקות לצורך קירור. שטפו הומוגנייזר עם באפר היפוטוני ולאחר מכן הניחו אותו על קרח יחד עם התאים.

לאחר מכן, ייבשו את העלי למיטב בעזרת מטלית עדינה למשימות עדינות, כגון Kimwipe. השתמשו בטיפ מאורך של מיקרופיפט ל-1000 microliter כדי להסיר את הבופר מהמכתש. כעת השתמשו בפיפט כדי להעביר את התאים הנפוחים והמקוררים אל תוך המכתש.

החלק המאתגר ביותר בפרוצדורה זו להבטחת הצלחה הוא הבדיקה לליזיס. לאחר כל שלב תחת המיקרוסקופ, הניעו באיטיות את העלי של המכתש למעלה ולמטה חמש פעמים כדי לבצע ליזיס לתאים, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות. לאחר מכן, העבירו 5 µL של תגלי המבחנה של תרחיף התאים שעברו ליזיס לשפופרת איפנדור והוסיפו 10 µL של trypan blue ו-15 µL של 1X PBS.

הוסיפו את תמיסת התאים לסלייד ובחנו את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לבדוק ליזיס; גרעיני התאים שעברו ליזיס ייראו כחולים לאחר שלוש שניות. רמת הליזיס אינה מספקת שכן נראים תאים חיים רבים. לאחר חמש שניות, רמת הליזיס מספקת.

לבסוף, העבר את התאים שעברו ליזה לשפופרת איינור (einor) שקוללה מראש, וסבב את תרחיף התאים במשך חמש דקות במיקרו-צנטריפוגה במהירות של 1500 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, העבר בזהירות את supernatant לשפופרת חדשה מבלי להפריע למשקע (pellet). כעת, הערק את נפח הגרעין המצומצם (patch nuclear volume) או ה-PNV על ידי התבוננות במדדי הנפח שעל השפופרת.

מלאו קצה של מיקרופיפט בבופר בעל מליחות נמוכה בנפח השווה למחצית מה-PNV. לאחר מכן, הכניסו את קצה המיקרופיפט אל תוך הגרעינים בתחתית מבחנת ה-einor. התיזו את הבופר לאט לתוך הגרעינים תוך כדי ערבוב עדין.

נער את המבחנה בעדינות באמצעות נקישה כדי לוודא שהמשקע הוחזר כולו לתמיסה. לאחר מכן, הוסף באפר מלח גבוה (high salt buffer) בנפח השווה למחצית מה-PNV וערבב במהירות פעם אחת על ידי היפוך המבחנה. סובב את המבחנה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

לבסוף, סובבו את הגרעינים במיקרו-צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-18,000 ×g ובטמפרטורה של 4°C. התחילו בהעברה של 500 µL מהנוזל העליון (supernatant) לתוך מיקרו-קונס (micro cons) מקוררים. סובבבו את תמצית הגרעין בריכוז מלח גבוה למשך 15 דקות ב-14,000 ×g ובטמפרטורה של 4°C; לאחר הצנטריפוגה, הפכו את המיני-ראקון (mini racon) והניחו אותו בתוך מבחנת EOR חדשה.

לאחר סבב צנטריפוגה של שתי דקות ב-1000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C, תמצית הגרעין במלח גבוה תרוכז לנפח של כ-115 µL. כעת, העבר מנות של 45 µL מתמצית הגרעין במלח גבוה אל תוך mini dialysis SLIs. ודא שחלקן התחתון של השקופיות נושק לחלקו התחתון של הציף.

לאחר מכן, העבירו את ה-SLIs ל-500 milliliters של תמיפת דיאליזה מקוררת. לבסוף, ערבבו את המנות למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 4 °C; התמצית הגרעינית תיראה עכורה לאחר הדיאליזה. איור זה מציג נתונים מייצגים המשווים תגובה מצומדת של שעתוק על ידי RNA polymerase two ועיבוד (splicing) בתמצית גרעינית בקנה מידה קטן לעומת תמצית גרעינית בכמות גדולה.

כאשר תבנית A-C-M-V-D-N-A הודגרה בתמציות הגרעין בכמות גדולה (bulk) או בקנה מידה קטן, רמות דומות של pre-mRNA ראשוני סונתזו עד לנקודת הזמן של חמש דקות; לאחר הוספת alpha ו-manin כדי לחסום טרנסקריפציה נוספת, תוצרי השחור (splicing) ותוצרי הביניים של השחור הצטברו עם הזמן בקינטיקה דומה בשני סוגי התמציות. תוצאות מייצגות אלו מאשרות כי הנצילות של מערכת הטרנסקריפציה והשחור המשולבת של RNA polymerase II היא דומה בתמציות הגרעין בכמות גדולה ובקנה מידה קטן. כדי להדגים את התועלת של התמצית בקנה מידה קטן, הוכנו תמציות מתאי HeLa שטופלו במעכב השחור E 7 1 0 7 או בתרכובת הביקורת השלילית Platy analy F, ולאחר מכן בוצע ניסוי משולב של טרנסקריפציה ושחור על ידי RNA polymerase II כפי שמוצג באיור זה; טרנסקריפציה על ידי RNA polymerase II התרחשה ביעילות בתמציות שהוכנו הן מהתאים שטופלו ב-plaid F והן מאלו שטופלו ב-E 7 1 0 7.

לעומת זאת, השחור (splicing) התרחש באופן תקין בתמצית שהוכנה מתאים שטופלו ב-analy F, אך בוטל בתאים שטופלו ב-E 7 1 0 7. נתונים אלו מספקים הוכחת היתכנות לשימוש בתמציות גרעיניות בקנה מידה קטן עבור טיפולים מיוחדים בתאים בכמויות קטנות. לאחר שולטה בשיטה, ניתן להשלים אותה בפחות מחמש שעות.