ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב

המטרה הכללית של הליך זה היא לשפר את הגילוי של גרורות מיקרוסקופיות בריאות עכבר ex vivo, תוך שימור המבנה של הריאות המנופחות. זאת מושגים תחילה על ידי ביצוע פרפוזיה לריאות in situ באמצעות PBS להסרת הדם, המהווה את מקור הרקע הצבעוני העיקרי ברקמה זו. השלבים הבאים כוללים ניפוח של הריאה באמצעות הזרקת PFA, ולאחר מכן קשירה (pinch off) לצורך קיבוע רקמת הריאה במצב נפוח.

בשלב הבא, מוציאים את הריאה ומקבעים אותה באופן נוסף ב-PFA, או שמטמיעים אונו של ריאה בודדת לצורך חיתוך קריוסטטי. השלבים הסופיים כוללים צביעה של הרקמות בתמיסת Xal והדמיה של תאי גידול LA zag; בסופו של דבר, ניתן לזהות גרורות באונו של ריאה שלמה או בחתכי רקמת ריאה עד לרמת התא הבודד באמצעות מיקרוסקופ בינוקולרי או מיקרוסקופ אור. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון sky standing on its own, הוא שהיכולת לזהות מיקרו-גרורות משתפרת באופן ניכר הודות להסרת הרקע הקשור לדם.

התחילו את הפרוטוקול על ידי הרדמת עכבר באמצעות זריקה תוך-peritonal של ketamine, xylazine ו-ace promazine בערך ב-150 µL של PBS. כאשר לא נצפים עוד רפלקסי כאב של העכבר, קבעו אותו על שולחן הניתוח. גלחו את הפרווה והחליקו אותה עם 70% ethanol.

פתחו את העור מהבטן ועד לצוואר. משכו את העור לצדדים או הסירו אותו. פתחו בזהירות את הפריטוניאום בחזה כדי למנוע קרע של כלי דם גדולים כמו הוורידים הג'וגולריים (venina jugulars).

פעולה זו תשפר את יעילות הפרפוזיה. כעת, חתוך את ה-vena cava cardis מתחת לכבד באמצעות מזרק של 20 מיליליטר עם מחט בכיול 21 עד 24 gauge. הזרק באיטיות 10 עד 15 מיליליטר PBS לתוך החדר הימני של הלב הפועם, עד שהריאה תהיה לבנה לחלוטין והלב יפסיק להפעים.

לאחר מכן, צבטו את כלי הדם שמעל הכבד והסרעפת בעזרת תפס כלי דם. מלאו מזרק של 10 מיליליטר ב-3% paraform aldehyde, והזריקו לתוך החדר הימני באמצעות מחט בקוטר 21 עד 24 gauge. כמות של כשני מיליליטרים.

חשוף את הקנה מחוץ לבית החזה ונפח את הריאה על ידי הזרקה לקנה של כ-3 milliliters של אלדהיד מחוץ לבית החזה. מיד לאחר הוצאת המחט, סגור את הקנה באזור הדקירה באמצעות תפסנית כלי דם והמתן 10 דקות לאפשר את הקיבוע. לאחר מכן, חתוך את כלי הדם מעל לתפסנית כלי הדם.

לאחר מכן הסר את התפס והזרק כ-2 mL של PBS לתוך החדר הימני כדי להסיר שאריות פורמלדהיד. נקב בעזרת מחט את החלקים התחתונים של כל אונוני הריאה והסר את התפס הווסקולרי מהקנה. כעת הזרק 3 עד 5 mL של תמיסת שימור (embedding solution) מדוללת אל תוך הקנה, באופן תואם להזרקה הקודמת.

הפסיקו את ההזרקה כאשר הפראפורמליד באונות הריאה מוחלף על ידי התמיסה. הוציאו את הריאה בזהירות על ידי משיכת הלב באמצעות פינצטה וחיתוך של רצועות רקמה מחברת, כלי דם והקנה. ודאו שהלב נשאר מחובר לריאות.

הפרידו אונה אחת לצורך חתכים קריוגניים והשתמשו ברקמת הריאה הנותרת לצביעה של איברים שלמים. הניחו את הריאה בכוס פלסטיק עם מכסה אטום וקבעו אותה ב-2% formaldehyde ו-PBS. הניחו פיסת גזה מעל הריאה כדי להבטיח את הישארותה בתמיסה והשאירו אותה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר חצי שעה, הסירו את תמיסת הקיבוע ושטפו את הרקמה היטב עם PBS שלוש פעמים. הכינו תמיסת Xal מוכנה לשימוש על ידי דילול של מיליליטר אחד של תמיסת Xal מקורית ביחס של 1:40 בתמיסת הצביעה הבסיסית, והוסיפו לפחות 10 milliliters ממנה אל הכלי. השקיעו את הריאה באמצעות פיסת גזה. סגרו את המכסה באופן רופח כדי לאפשר חילוף אוויר והדגרימו בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד חמש שעות, כשהדגימה מוגנת מאור.

לאחר הדגירה, הסירו את תמיסת ה-xal. שטפו את הריאות פעם אחת עם PBS כדי להסיר שאריות של תמיסת ה-xal והוסיפו לפחות 10 milliliters של 4% paraform aldehyde ב-PBS. הרקמה מוכנה כעת להיסטולוגיה וניתנת לאחסון לטווח ארוך ב-4% PFA בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס.

התחילו במילוי של שליש מתבנית השקיעה במדיום שקיעה poly forze לא מהול. לאחר מכן, הכניסו את נאחית הריאה לתבנית והמשיכו להוסיף מדיום עד שהנאחית תהיה מכוסה לחלוטין. הימנעו בזהירות מיצירת בועות אוויר, וכעת הדגירו את הנאחית השקועה בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות.

בשלב הבא, הכין את הריאות המוטמעות לחיתוך על ידי הקפאה איטית בתערובת של קרח יבש ואיזופנטאן. במידת הצורך, ניתן להעבירן כעת למקפיא של 80- מעלות צלזיוס לאחסון. באמצעות קריוסטט, חתוך נתחים קריוגניים בעובי של 7 עד 10 מיקרון מהאונו. העבר את הנתחים לשקופיות מוכנות לחיתוכי קריו הזמינות מסחרית. לאחר ההעברה, דגור מיד את הנתחים בתמיסת צביעה xal בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בתא לח. למחרת, שטוף את השקופיות ב-PBS פעמיים למשך חמש דקות לכל שטיפה.

בצע לאחר מכן שטיפה קצרה במים מזוקקים. כעת צבע את השקופיות בצבע נגד (counterstain) מסוג nuclear fast red למשך 10 שניות כדי לקבל צביעה חלשה שתדגיש את ה-xal, ושטוף מיד את צבע הנגד במים מזוקקים. לצביעה כהה יותר, האריך את זמן הצביעה עד 30 שניות או יותר.

הצמידו את השקופיות באמצעות תמיסת הצמדה אימונוגנית (immuno mount). נבדקה מחדש היווצרות גרורות במודלים של OS בעכברים מסוג done LM eight. השתמשו בתמונות הנציגיות המתוארות כאן של ריאות מפורפרו (perfused) וריאות שאינן מפורפרו של עכברים שהוזרקו בו-זמנית תאי done ו-LM eight שעברו טרנסדוקציה של laxy ותאי done ו-LM eight שאינם טרנסדוקטד (בקרה), וכן בעכברים שהוזרקו תאי done של בקרה.

גרורות מאקרוסקופיות ומיקרוסקופיות נותרו בלתי ניתנות לזיהוי בריאות שאינן מבושנות ובריאות מבושנות. אך באופן מעניין, בעכברים שהוזרקו תאי dun LA Z, צביעת xgl חשפה מוקדים מיקרו-גרורתיים כחולים של תאים בודדים או מקבצי תאים קטנים על פני ריאות שאינן מבושנות; ביצוע פרפוזיה וקיבוע של הריאות במקום (in situ) שיפרו עוד יותר את יכולת הזיהוי של מיקרו-גרורות dun la z. עם זאת, לא נצפתה צמיחה למוקדים מאקרוסקופיים בעכברים שהוזרקו תאי LM eight של ביקורת. מוקדים מאקרו-גרורתיים שקופים, שבקושי ניתן היה לזהותם וקוטרם גדול מ-0.1 millimeter, זוהו בריאות שאינן מבושנות. פרפוזיה של הריאה לא שיפרה את זיהוי המוקדים.

עם זאת, בעכברים שהוזרקו להם תאי ate LAC Z, זוהו מספר גרורות מאקרו כחולות בצביעת X gal על פני איברים שאינם מבושפים. כמו כן, זוהו גרורות מיקרו על פני איברים שאינם מבושפים. יתרה מכך, ביצוע פרפוזיה לריאות שיפר עוד יותר את יכולת הגילוי של גרורות מאקרו ומיקרו.

כתוצאה מכך, גרורות מיקרו ומקרו הפכו לנראות בצפיפות גבוהה יותר ובמספר רב יותר, בעיקר בשל השקיפות של הרקמה המבושפת, שגרמה לכך שמוקדים הנמצאים מתחת לפני השטח של האיבר הפכו גם הם לנראים. ניתוח היסטולוגי נוסף באמצעות חתכי קריו של רקמת ריאה אישר את השיפור ביכולת הגילוי של גרורות ריאה בעכברים שהוזרקו תאי LAX Z transduced done ו-LM eight, ובעכברים עם גידולי ראשוניים שהגיעו מתאי Dun LAX Z. גרורות מיקרו או אפילו מוקדים של תא בודד זוהו בחתכי הריאה.

דבר זה לא נצפה בעכברים עם גידולים ראשוניים של תאי הבקרה המתאימים. יתרה מכך, גרורות מאקרו היו גלויות יותר בעכברים שהוזרקו עם תאי LM eight LA C מאשר בבעלי חיים עם תאי הבקרה LM eight. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ביצוע פרפוזיה וקיבוע של ריאות ב-ZI two, ושל צביעה עוקבת של הגרורה בריאות שהוצאו.

טכניקה זו מהווה מדד קצה רגיש מאוד לפיזור גרורות בריאה בכל סוג של מחקר סרטן, והיא יכולה לשמש גם כנקודת ייחוס לשיפור טכניקות דימות in vivo קיימות, כגון micro ct PET ו-MRI, המשמשות לזיהוי מוקדם של נגעים מטאסטטיים.