הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאפשר מדידה כמותית של ניידות תאית לאורך זמן באמצעות בדיקת ניידות תאים המבוססת על ננו-חלקיקי זהב. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת זכוכיות כיסוי לציפוי בננו-חלקיקי זהב. באופן ספציפי, זכוכיות כיסוי נקיות מאנדוטוקסינים מצופות בג'לטין ולאחר מכן עוברות אפייה.

השלב השני הוא חיזור של חומצה כלורואורית, שיצור ננו-חלקיקי זהב, וציפוי אחיד של הזרימיות המצופות ג'לטין בתמיסה. לאחר מכן, התאים מונחים על הזרימיות המצופות בננו-חלקיקי זהב למשך פרק הזמן הרצוי של ניסוי התאים. בהמשך, הג'לטין ידחף את ננו-חלקיקי הזהב ויצור מסלולים.

השלב הסופי הוא ניטור וכימות של ניידות תאים באמצעות מיקרוסקופיה לדגמיון של המסלולים שנוצרו על ידי התאים הנעים. לבסוף, מדידות שטח של המסלולים מבוצעות באמצעות תוכנה הזמינה בחינם. אחד היתרונות המרכזיים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימוי במרווחי זמן (time lapse imaging), הוא שבדיקה זו דורשת רק מיקרוסקופ אור סטנדרטי, מצלמה סטנדרטית, ומשתמשת בתוכנת דימוי הזמינה בחינם.

בנוסף, הבדיקה מאפשרת בקלות ניתוח והשוואה של דגימות מרובות באמצעות שיטה המסוגלת לסריקה בשנייה גבוהה (high throughput screening). למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי השפעתם של גורמים פיזיולוגיים שונים ותנועת תאים, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון מחקרים על ההשפעות של פתוגנים על ניידותם של תאים נגועים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות, כיוון שהיא דורשת הקפדה יתרה על הנפחים והטמפרטורות המצוינים בפרוטוקול.

בפרוטוקול זה, מושם דגש על הערכת צבעו של התמיס הסופי של ננו-חלקיקי הזהב ששקעו, על מנת להבטיח את הצלחת התהליך. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי בדיקת ניידות מסלול הקינטיקה של FGO קשים ללמידה.

הם כוללים מספר פרוצדורות שאינן נפוצות במעבדות לביולוגיה תאית ומולקולרית. כדי להכין כיסית זכוכית (coverslip) מצופה ג'לטין, תחילה השעו את הג'לטין במים דה-יוניים כדי להכין תמיסה בריכוז סופי של 0.5 גרם ל-300 מיליליטר, ולאחר מכן עקרו את התערובת באוטוקלאב למשך 15 עד 30 דקות. חשוב לבצע פעולה זו בתוך שעתיים מהוספת הג'לטין, בתוך מ نتیבת תרביות רקמה.

הכינו את כיסויי הזריקה לציפוי על ידי העברה של שמונה עד תשעה כיסויי זריקה שטופים בחומצה אל צלחת פלסטיק של 100 מילימטר. ודאו שכיסויי הזריקה אינם נוגעים זה בזה או בדפנות הצלחת. טפטפו בזהירות שתיים עד שלוש טיפות ג'לטין על כל כיסוי זריקה, תוך הימנעות מגלישה אל הצלחת.

לאחר מכן, הניחו את הצלחית המכילה את כיסויי הזכוכית (cover slips) המצופים בג'לטין בתנור ואפו בטמפרטורה של 90 °C למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, הוציאו את הצלחית מהתנור והחזירו אותה למכסה הרקמות (tissue culture hood).

שאבו בעדינות כל שארית ג'לטין. החזירו את הצלחת לתנור ויבשו את הזכוכיות המכסות בטמפרטורה של 70 °C למשך 45 דקות. לאחר שהזכוכיות המכסות יבשו, הוציאו את הצלחת מהתנור והחזירו אותה למCבט (hood) לתרביות רקמה.

בעזרת מחט סטרילית ובזהירות, הרימו צד אחד של זכוכית הכיסוי. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להוציא את זכוכית הכיסוי המצופה בג'לטין מהצלחת והניחו אותן בבארים נפרדות של פלטת 24 בארות. השלב הבא הוא הכנת זכוכית כיסוי מצופה בזהב קולואידי.

התחילו בהכנת 10 מיליליטר של תמיסת sodium citrate בריכוז 0.5%, תוך עבודה במCב מצע תרביות רקמה, על ידי שילוב של 1.5 מיליליטר של תמיסת chloro ORIC acid בריכוז 14.5 מילימולרי ו-13.5 מיליליטר של מים דה-יוניים שעברו עיקור באוטוקלאב בתוך בקבוק ארלנמאייר סטרילי נטול אנדוטוקסינים. עבור כל שמונה עד תשעה כיסויים של הזלגית, התוצאה צריכה להיות תמיסה צהובה חיוורת. chloro ORIC acid הוא רעיל ויש לטפל בו בזהירות. הוא גם רגיש לאור, לכן יש לבצע את שלב ההרחאה בתנאי תאורה נמוכים.

כאשר התמיסה תגיע לנקודת הרתיחה שלה, הוציאו את הבקבוק מהפלטה המחממת והעבירו אותו לפלטה מגנטית. כדי להיווצר חלקיקי זהב קולואידליים בתמיסה, הוסיפו 0.7 milliliters של תמיסת sodium citrate בריכוז 0.5% לכל 15 milliliters של תמיסת chloroauric acid תוך כדי ערבוב, והמשיכו לערבב למשך כשתי דקות. במהלך זמן זה, צבע התמיסה ישתנה מצהוב חיוור לשקוף, לאפור, לסגול ולסגול כהה.

לפני ההגעה הסופית לצבע יין אדום או, באופן עדיף, לצבע חלודה, שאבו את תמיסת הזהב הקולואידלי באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר והמתינו דקה עד שתיים שהתמיסה תתקרר בפיפטה עד שתגיע לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 עד מיליליטר אחד על גבי זכוכית המכסה המצופה ג'לטין בלוחית ה-24 בארות. הניחו את לוחית ה-24 בארות המכילה את זכוכית המכסה המצופה בזהב קולואידלי באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C והדגירו למשך 30 דקות. לאחר שלחלקיקים היה זמן לשקוע על גבי זכוכית המכסה המצופה ג'לטין, בדקו את צפיפותם תחת מיקרוסקופ אור.

פיזור הולם של ננו-חלקיקי זהב מסייע להבחין בקלות וביעילות בקצותיהם של תאי שמש. הצפיפות האופטימלית משתנה בהתאם לגודל התא. ריכוז גבוה מדי של חלקיקי זהב מעכב את יכולת התנועה של התאים, בעוד שריכוז נמוך מדי של חלקיקי זהב מגביל את היכולת לתחום מסלול ניידות מדויק.

מסיבה זו, יש להשתמש בניסויים בודדים רק בכיסויות שהוכנו באותה סדרה או שסומנו כבעלות צפיפות זהה. אם ריכוז חלקיקי הזהב אינו מספיק, הוסיפו 0.5 עד 1 מיליליטר נוסף של תמיסת הזהב הקולואידי לכיסויות המצופות בג'לטין. עם זאת, אם ריכוז חלקיקי הזהב גבוה מדי, כפי שמוצג כאן, הבחירה היעילה היחידה היא להכין מחדש את תמיסת הזהב הקולואידי ולצפות כיסויות חדשות.

אם צפיפות החלקיקים נכונה, החזירו את הצלחת לאנקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius והדגרימו למשך שעה אחת עד לילה. שטפו חלקיקי זהב שאינם קשורים על ידי טבילה של כיסויי הזכוכית (cover slips) שלוש פעמים בתמיסת phosphate buffered saline סטרילית. לאחר מכן, אחסנו את כיסויי הזכוכית המצופים בזהב קולואידי בבארים מלאות ב-PBS של פלטת 12 בארים נקייה בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius עד למועד השימוש. אין לאפשר לכיסויי הזכוכית להתייבש ויש להשתמש בהם בתוך שני עד שלושה חודשים מיום הכנתם.

השלב הבא הוא הכנת כיסויי הזכוכית (cover slips) מצופים בזהב קולואידי לתרבית תאים. התחילו בהנחתם לתוך בארות בודדות של פלטת 24 בארות, אליהן הוספו כ-0.3 milliliters של מצע גידול לפני הוספת כיסויי הזכוכית. העבירו כ-5,000 עד 50,000 תאים על כל כיסוי זכוכית מצופה בזהב קולואידי. מספר התאים ישתנה בהתאם לסוג התא, אך צפיפות התאים חייבת להיות נמוכה מספיק כדי למנוע חפיפה של עקבות תאים ממספר תאים באותו אזור.

כסו את הצלחת והניחו אותה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך שש עד 24 שעות. בהתבסס על הניידות של סוג התא, יש לקבוע ניסיונית את מסגרת הזמן האופטימלית עבור כל סוג תא. לאחר ההדגרה, קבעו כל כיסוי זכוכית (cover slip) שלא ינותח באופן מיידי, תחילה על ידי טבילה פעמיים ב-PBS ולאחר מכן על ידי הדגרה ב-3% para formaldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השתמשו במיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות של העקבות שהותירה תא בודד הנע על כיסויי זכוכית לא מקובעים או מקובעים. ההגדלה המשמשת לצילום עקבות תאיים משתנה בהתאם לסוג התא. עם זאת, יש להשתמש באותה הגדלה עבור כל מחקר על מנת שניתן יהיה להשוות את התוצאות.

עבור מונוציטים, הגדלה של 40x עובדת היטב. באמצעות תוכנות הזמינות בחינם כגון ImageJ, JNIH image או Image Tool, קבעו את השטח הממוצע של זהב קולואידי שנוקה על ידי 10 עד 20 תאים או יותר עבור כל דגימה. התמונות הצלומות המוצגות כאן מראות את הנתיב שנוקה מחלקיקי זהב קולואידי על ידי מונוציט בודד שאינו מעורר, אשר צולמה עם עדשה של 40x. תאים שאינם ניידים יוצרים עקבות אופייניות קטנות בצורת אליפסה או עיגול סביב עצמם, דבר המעיד על רמה נמוכה של תנועה. לעומת זאת, תאים בעלי ניידות גבוהה מאופיינים בתנועה כיוונית המופיעה כעקבות מוארכות ובשטחים כוללים גדולים יותר בשל צורותיהם הבלתי סדירות.

מומלץ לנתח מסלולי תאים באמצעות כלי השרטוט החופשי (freehand tool) בתוכנת Image J כדי להתוות את נפחם. לאחר מכן, ניתן לבצע מדידות כמותיות של השטח באמצעות כלי המדידה (measure tool) בתפריט הניתוח של Image J. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להקפיד באופן קפדני על הנפחים והטמפרטורות המצוינים בפרוטוקול, שכן סטיות עלולות להשפיע משמעותית על התוצאות הסופיות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת זכוכיות כיסוי מצופות ג'לטין, אופן הכנת ננו-חלקיקי זהב וזכוכיות כיסוי מצופות ננו-חלקיקי זהב, וכיצד לנטר ולהעריך כמותית תנועת תאים באמצעות מיקרוסקופיית אור.

זכרו כי עבודה עם תמיסות רותחות על פלטה חשמלית, ובמיוחד אדי התמיסות הרותחות של fluoro, AIC acid ונתרן ציטראט, עלולה להיות מסוכנת; יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה, כגון עבודה תחת מapay (מכסה) ושימוש בשכל ישר.