על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל
21 ביולי 2012
חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.
מטרת סרטון זה היא להדגים טכניקת מעבדה על שבב (lab on a chip) לאפיון המצב הדלקתי של תאי אנדותל. ראשית, תאי אנדותל מאורטה אנושיים גודלים עד להשגת התלכדות (confluence) על מצע לתרבית רקמות, ולאחר מכן מוכנסים למכשיר גזירה מסוג לוחית Conan. התאים מטופלים בציטוקין פרו-דלקתי, TNF alpha, ובמקביל נחשפים לתנאי מאמץ גזירה דיפרנציאליים במשך ארבע שעות באמצעות בקרה מדויקת של סיבוב החרוט מעל המצע; מאמץ הגזירה מווסת תגובה דלקתית מאופיינת היטב לציטוקין.
זה כולל ויסות חיובי של מולקולות הדבקה כגון VCA one ו-ICAM one. המצע מועבר לבמה של מיקרוסקופ, שם התקן מיקרופלואידי מסוג A-P-D-M-S נחתם בוואקום ישירות אל השכבה החד-שכבתית (monolayer) ליצירת תעלות זרימה. תאי THP one מונוציטיים מופעלים מוזרמים מעל ה-hs שהוכנו מראש, שם הם נקשרים באופן הפרופורציונלי לרמת הביטוי של מולקולות הדבקה תאיות.
המצב הדלקתי של האנדותל נקבע על ידי כימות המספר הכולל של תאי THP-1 שנעצרו באופן יציב. היי, שמי הוא שי דייברס, ואני גרג פוסטר. ואני קית' ביילי.
אנו נמצאים במעבדותיהם של הפרופסורים פסטור וסימון במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת קליפורניה ב-Davis. היום נתאר את השימוש בגישה המבוססת על מעבדה על שבב (lab on a chip) כדי לבחון באופן כמותי תפקוד לקוי של האנדותל ודלקת. כלים אלו מספקים פלטפורמה המאפשרת לנו לבצע מחקרים הנוגעים להסמיכות של עקה מטבולית עם גורמים הידרודינמיים, ולבקרת הפנוטיפ הדלקתי של האנדותל והנטייה לאתרוסקלרוזיס.
אנו מכנים את המכשירים שלנו תאי מיקרופלואידיקה המדמים כלי דם, או vmmc. מכשירים אלו מאפשרים לנו לכמת תוצאות דלקתיות בתאי אנדותל ובמונוציטים תחת תנאים המדמים את אלו בכלי דם אתרוגניים. ה-VMMC מקל על השימוש בכמויות קטנות של ריאגנטים או חומרים שעשויים להיות במלאי מוגבל.
ניתן לבנות אותם במגוון פריסות וגיאומטריות הניתנות להתאמה אישית, מה שהופך אותם למתאימים מאוד למגוון רחב של יישומים. היום נדגים ניסוי מייצג באמצעות גישת המעבדה על שבב שלנו. שכבות מונו-שכבה של תאי אנדותל אנושיים ייחשפו להפעלה על ידי ציטוקינים תחת מאמצי גזירה מוגדרים היטב.
אנו נדגים את השימוש ב-VMC לכימות גיוס תאי מונוציטים אנושיים לשכבה החד-שכבתית בזמן אמת כמדד תפקודי להפעלה אנדותליאלית; באמצעות מחרטה, מכינים מצעים מעגליים בקוטר של שלושה אינץ' מתוך צלחות לתרבית רקמות של 100 מילימטר. המצעים בגודל שלושה אינץ' נשטפים במים מזוקקים, ולאחר מכן עוברים סטריליזציה על ידי השריה ב-70% ethanol. המצעים הסטריליים מונחים בצלחות פטרי של 100 מילימטר ומושארים לייבוש.
לאחר מכן מדגירים אותם עם קולגן מסוג 1 בריכוז של 100 µg/mL למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ושוטפים עם PBS. תאי אנדותל מאורטה אנושיים (HA) מושעים בריכוז של 650,000 תאים למילליליטר. מניחים טיפות של 1 מילליליטר מתלי התאים על מצע מיובש מצופה בקולגן ומרחיבים אותן לתלייה אחידה.
מその後, המצעים המיושבים מועברים לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 כדי לאפשר להם להיצמד לפני השטח של המצע. לאחר שעה, מוסיפים 9 mL של מצע גידול EGM-2, והתאים נשארים לגדול לשכבות מונושכבה (Monolayers). כאשר מגיעים לצפיפות של כ-90% (confluency), המונושכבות מוכנות לשימוש בניסויי גזירה (shear experiments) עוקבים. תאי מיקרופלואידיקה המדמים כלי דם נבנים על ידי יציקת תבנית PDMS על גבי תבנית מאסטר הכוללת את גאומטריית התעלה הרצויה.
בסיס סיליקון נשפך לתוך סירת יציקה מפלסטיק, ולאחריו חומר המקשה של הסיליקון ביחס של 10 ל-1 לפי משקל. לאחר מכן מערבבים היטב את ג'ל ה-PDMS, תוך הקפדה לא לגרד את דפנות סירת היציקה, כדי למנוע הכנסת שבבי פלסטיק לתערובת. תבניות מאסטר של פוטורזיסט מנוקות עם hexane ומוכנות ליציקת ה-VMMC.
לאחר מכן שופכים את תערובת ה-PDMS על גבי תבנית המאסטר, ומכניסים אותה לתא ואקום. בתוך התא, האוויר מוסר מתערובת ה-PDMS ועולה לפני השטח לאחר 15 דקות.
מוציאים את התבנית מהתא ומנשבים אוויר בעדינות על פני השטח של ה-PDMS כדי לסלק בועות אוויר שנותרו בתבנית. לאחר מכן מכסים את התבנית ומניחים אותה בתנור בטמפרטורה של 37 מעלות למשך שעה, כדי לאפשר ל-PDMS להתקשח. מוציאים את ג'ל ה-PDMS שהתקשח מהתנור ומבצעים חתכים מעגליים מסביב לתא באמצעות סקלפל קטן.
חשוב לבצע זאת בהדרגה כדי למנוע מגע עם חומר הפוטורזיסט, שכן דבר זה יפגע בתבנית המאסטר. חלץ את תא המיקרופלואידיקה מנקבי הכניסה והיציאה של התבנית עבור כל תעלה באמצעות מחט Luer Lock בכיול 19 gauge. בנוסף, נקב חורים עבור צינורות הוואקום הרחוקים מהתעלות.
ההכנה ל-VMMC כעת הושלמה. טפטפו באמצעות פיפט את הציטוקין הפרו-דלקתי TNF alpha לתוך ששה מיליליטר של מצע L 15 כדי להגיע לריכוז סופי של 0.5 nanograms per milliliter. מצע L 15 משמש כאן כנוזל הגזירה בשל יכולת בקרת ה-pH שלו בהיעדר 5%CO2.
לאחר מכן שואבים את המצע למזרק סטרילי של 10 milliliter, המשמש לטעינת מכשיר הגזירה. את השכבה החד-שכבתית (monolayer) הצפופה מעבירים למכשיר גזירת התאים, שעומד כעת סטרילי לאחר חיטוי באתנול, מפולס, וגובה המרווח של הקונוס נקבע. את התשתית מוציאים מבתרי הדש ומניחים על בלוק המדידה מזכוכית, ממקמים במרכז ומכניסים בזהירות לתחתית תא המארח, כך שהקונוס נמצא ישירות מעל התאים.
המצע מקובע על ידי הידוק אחיד של ברגי פלדת אל-חלד מסביב לבלוק המדידה. לאחר מכן, מדיה הגזירה נטענת לתוך התא, תוך הקפדה שלא להחדיר בועות אוויר. בשלב הבא, נעזרים במחשב כדי להזין את תוכנית מאמץ הגזירה הרצויה, והמנוע המיקרו-ספרטי מופעל.
כאן אנו משתמשים בגזירה תנודתיות של 0 פלוס או מינוס 5 dines per centimeter squared. לאחר ארבע שעות, תוכנית הגזירה מופסקת. גוש המדידה מוסר והמצע מוחזר בזהירות אל כלי הפטרי.
התאים מוכנים כעת לבדיקת היצמדות מונוציטים. מיד לאחר הגזירה, השכבות החד-שכבתיות של HA מועברות לתחנת המיקרוסקופ להרכבת ה-VMMC. ה-VMMC מחובר לצינור הוואקום וטבול במי DI כדי להסיר בועות אוויר כלשהן שנלכדו בתוך התעלות.
כאשר שסתום הוואקום כבוי בתחילה, לוחצים בזהירות את התא על גבי השכבה החד-שכבתית (monolayer) ומפעילים את שסתום הוואקום. בשלב זה קריטי לוודא שלא נלכדו בועות אוויר בתוך התעלות של התא. כעת, מפליטים 80 µL של HBSS עם סידן ומגנזיום לתוך מאגר שנוצר על ידי חיתוך הקצה של מחט Luer Lock בכילייב 19; הנוזל נדחף החוצה מהקצה על ידי לחיצה חזקה על חלקו העליון של המאגר, אשר מוחדר לאחר מכן לפתח הכניסה של ה-VMMC.
את כל המכלול מניחים עלבמת המיקרוסקופ ומפעילים את מצלמת המיקרוסקופ ואת מסך הווידאו. מזרק זכוכית של 10 milliliter מותקן על משאבת המזרקים. לאחר מכן, מחברים את צינורית המזרק לפתח היציאה של ה-VMMC.
קצב הזרימה נקבע כדי להשרות מאמץ גזירה של one dine לסנטימטר רבוע בתוך התעלה, ולאחר מכן מופעל במצב מילוי חוזר כך שהמזרק שואב נוזל מהמאגר דרך התעלה. תאי ה-P one שעברו גרייה באמצעות SDF one מושעים בריכוז של 2 מיליון תאים למיליליטר. תוך שתי דקות מהפעלת הזרימה, מוסיפים למאגר 50 µL של תליה תאית.
שוב, יש להקפיד לא להחדיר בועות אוויר בעת הגעה לזרימה מלאה. הווידאו מוקלט בקצב של שלושה פריימים לשנייה והנתונים נספרים באמצעות תוכנת Image J. תאי THP-1 נחשבים לדבקים (Adherent) אם הם נעים מרחק שאינו עולה על חצי מקוטר התא בתוך 10 שניות.
כאן אנו מציגים נתונים המתארים היצמדות של תאי THP-1 לשכבות מונו-שכבה של תאי אנדותל (ha) שעברו גרייה באמצעות TNF alpha והותנו תחת מאמץ גזירה קבוע גבוה של 15 dyn/cm² או תחת מאמץ גזירה תנודתי של 0 ± 5 dyn/cm². שכבות מונו-שכבה של תאי ha שהותנו במאמץ גזירה תנודתי הראו גיוס תאי THP-1 הגבוה פי שלושה בהשוואה לשכבות מונו-שכבה שנחשפו למאמץ גזירה גבוה. כיום, אנו מדגימים את השימוש בטכניקות in vitro הניתנות להתאמה אישית, אשר ניתן לשלב כדי לספק תובנות חשובות לגבי אירועים דלקתיים מוקדמים העומדים בבסיס טרשת העורקים. באופן ספציפי, אנו מכמתים תוצאים הקשורים לתפקוד לקוי של האנדותל ולתאים שנחשפו לגירויים דלקתיים תחת תנאים הידרודינמיים מוגדרים היטב.
השימוש ב-VMM CS מאפשר לנו לבחון מנגנוים ספציפיים העומדים בבסיס אינטראקציות של היצמדות בין תאי אנדותל ללוקוציטים. למכשירים אלו יש יתרון נוסף בהיותם גמישים וזולים, והם מקלים על השימוש בחומרים שייתכן שהאספקתם מוגבלת, כגון רכיבים המופקים מסרום של נבדקים בני אדם. המחקרים שלנו שבהם נעשה שימוש במכשירים אלו כללו בדיקות של דלקת בתאי אנדותל המושרה על ידי ציטוקינים, ליפידים ו-rage.
פיתחנו גם בדיקות על שבב הבוחנות מנגנוני היצמדות בסוגים שונים של לוקוציטים וכן בדם מלא. בסופו של דבר, אנו צופים כי טכנולוגיה זו תוביל לגישות ex vivo להערכת הסיכון של הפרט למחלות קרדיווסקולריות המתווכות על ידי דלקת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים טכניקת מעבדה על שבב (lab-on-a-chip) לאפיון המצב הדלקתי של תאי אנדותל (ECs) באמצעות תאי זרימה מיקרופלואידיים. המחקר בוחן כיצד מאמץ גזירה דיפרנציאלי משפיע על היצמדות של תאי מונוציטים לשכבות מונו-תאיות של ECs שהופעלו באמצעות ציטוקינים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרופלואידיקה
רקע
- תאי אנדותל ממלאים תפקיד מכריע בדלקת ובבריאות כלי הדם.
- ידוע כי מאמץ גזירה משפיע על תגובות תאיות במערכת כלי הדם.
- הבנת תפקוד לקוי של תאי אנדותל (EC) יכולה לספק תובנות לגבי מחלות קרדיווסקולריות שונות.
- התקני מיקרופלואידיקה מאפשרים בקרה מדויקת של תנאי הניסוי.
מטרת המחקר
- לאפיין את התגובה הדלקתית של תאי אנדותל מאורטה אנושיים.
- לבחון את השפעות מאמץ הגזירה על היצמדות תאי מונוציטים.
- להשתמש בגישה של מיקרופלואידיקה לצורך בקרה ניסיונית משופרת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תאי אנדותל מאורטה אנושיים גודלו עד להגעה למצב של התלכדות (confluence).
- התאים טופלו ב-TNF alpha כדי להשרות דלקת.
- מאמץ גזירה דיפרנציאלי הופעל באמצעות מכשיר גזירה מסוג cone-plate.
- תאי THP-1 מונוציטיים הוכנסו כדי להעריך את רמות ההיצמדות.
תוצאות עיקריות
- מאמץ גזירה ויסת את הביטוי של מולקולות היצמדות כגון VCAM-1 ו-ICAM-1.
- ההיצמדות של תאים מונוציטיים הייתה פרופורציונלית לרמת הביטוי של מולקולות ההיצמדות.
- המערך המיקרופלואידי אפשר תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיות.
- התוצאות מדגישות את הגומלין בין כוחות מכניים לבין תגובות דלקתיות.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי תפקידו של מאמץ גזירה בדלקת של תאי אנדותל (EC).
- התקנים מיקרופלואידיים הם כלים יעילים לחקר דינמיקת היצמדות תאים.
- לממצאים עשויות להיות השלכות על הבנת המכניזמים של מחלות קרדיווסקולריות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גישת מעבדה-על-שבב זו מאפשרת הערכה כמותית של פנוטיפים דלקתיים אנדותליאליים תחת תנאים המודינמיים מבוקרים, ובכך נותנת מענה לפער קריטי בסיווג סיכונים קרדיווסקולריים מוקדם. על ידי קישור הפרעות מטבוליות לדינמיקת היצמדות של לוקוציטים במערכת in vitro הניתנת לשחזור, השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של מסלולים אתרוגניים ומסייעת לאסטרטגיות של תיקוף מטרות בגילוי תרופות קרדיווסקולריות. יכולתה של הפלטפורמה לדגמן מאמץ גזירה ואינטראקציות של ציטוקינים הרלוונטיים פיזיולוגית מספקת ערך חיזוי להערכת מועמדים טיפוליים המכוונים לתפקוד לקוי של האנדותליום.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של הבקרה ההמודינמית של מסלולים דלקתיים בתאי אנדותל אנושיים תחת תנאים מוגדרים של מאמץ גזירה (shear stress).
- ערך תפעולי: מספק קריאה כמותית של היצמדות מונוציטים כסמן ביולוגי תפקודי של מצב הפעלת האנדותל.
- ערך חיזוי: תומך בתיקוף מטרות על ידי קישור ביטוי של מולקולות היצמדות המווסת על ידי מאמץ גזירה (למשל, VCAM-1, ICAM-1) לגיוס לוקוציטים תחת גירויים דלקתיים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מבסס בדיקה מיקרופלואידית סטנדרטית למדידת אינטראקציות בין לוקוציטים לאנדותל בזמן אמת תחת זרימה פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: מאפשר דימות ברזולוציה גבוהה וכימות אוטומטי של תאים נצמדים באמצעות כלי ניתוח תמונות.
- מוכנות הבדיקה: מספק פנוטיפים דלקתיים הניתנים לשחזור ותלויים במאמץ גזירה, המתאימים לסריקת תרכובות ומחקרי מודולציה של מסלולים.
מחקרe טרנסלציונלי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדמה אירועים אתרוגניים מוקדמים על ידי שילוב גורמי סיכון מטבוליים (למשל, הפעלת TNF-α) עם פרופילי גזירה המודינמיים הרלוונטיים לגאומטריות עורקיות.
- המשכיות תרגומית: מגשן ממצאים in vitro לרגישות לאתרוסקלרוזיס in vivo באמצעות כימות תגובות אנדותליאליות פונקציונליות תחת תנאי זרימה רלוונטיים קלינית.
- קבלת החלטות מותאמת סיכון: מאפשרת תיעדוף של מטרות בהתבסס על הוויסות שלהן של פנוטיפים דלקתיים הרגישים לגזירה בתאים אנושיים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף הגילויים הקרדיו-וסקולרי, ותומכת בבדיקת השערות בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרה, מאפשרת פיתוח של בדיקות לגיוס לוקוציטים, ומספקת ניתוחים כמותיים להפחתת סיכונים מכניסטיים לפני התחייבות לשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת חקירה מכניסטית של האופן שבו כוחות המודינמיים מווסתים את האקטיבציה האנדותליית המושרה על ידי ציטוקינים ואת היצמדות הלויקוציטים.
- סריקה: מספקת בדיקה כמותית התלויה במאמץ גזירה להערכת השפעות של תרכובות על פנוטיפים דלקתיים אנדותליים תחת זרימה מבוקרת.
- אנליטיקה: מייצרת כימות מבוסס תמונה בזמן אמת של מונוציטים שהיצמדו באופן חזק, כקריאה תפקודית של מצב האקטיבציה האנדותליית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מדדים של תפקוד אנדותלי לקו לקו סיכון לאתרוסקלרוזה, על ידי מידול של מאמץ גזירה פיזיולוגי והכנה דלקתית בתאי אנדותל של אבי העורקים אנושי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה מיקרופלואידית ניתנת להגדרה מחדש, שניתן להתאימה לסוגי לויקוציטים, גירויים ופרופילי גזירה שונים בפרויקטי גילוי מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בדלקת אנדותליאלית על ידי הפרדה בין משתנים המודינמיים וביוכימיים במערכת מבוקרת.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור של הבדיקה באמצעות ייצור מיקרופלואידי סטנדרטי והפעלת מאמץ גזירה מדויק.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתונים מוקדמים הרלוונטיים לבני אדם על מודולציה של מטרות באינטראקציות אנדותל-לוקוציטים תחת זרימה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכון על ידי זיהוי מועמדים המנמיכים פנוטיפים דלקתיים המוגברים על ידי מאמץ גזירה במודלים רלוונטיים פתופיזיולוגית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון מיקרופלואידיקה, תרבית תאים תחת מאמץ גזירה, ובידוד או טיפול בלויקוציטים.
- תלוי בגישה לציוד לליתוגרפיה רכה, מערכות איטום בוואקום, ומיקרוסקופים הפוכים עם בקרת סביבה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של פרוטוקולי גזירה, מינוני ציטוקינים והכנת תאים כדי להשיג תוצאות הדירות בין מעבדות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למקורות אנדותל השונים (למשל, כלי דם כליליים, מיקרו-וסקולריים) או לסוגי לויקוציטים מעבר ל-THP-1.
- מגבלות מעשיות כוללות את מורכבות הרכבת ההתקן ואת הצורך ביצירת ערוצי מיקרופלואידיקה נקיים מבועות כדי להבטיח פרופילי גזירה עקביים.
