פרופיל מקיף של הסדרת substantia nigra הדופמין ואזור Tegmental הגחון

המטרה הכללית של הליך זה היא למקסם את המידע מהקריאות המולקולריות הקשורות לוויסות דופמין מתוך דיסקציה בודדת של רקמה מאזורי הסומטו-דנדריטים של המוח האמצעי. מטרה זו מושגת תחילה על ידי ביצוע דיסקציה מדויקת להפרדת ה-substantia nigra מהאזור הסגמנטלי הוונטרלי. השלב השני הוא עיבוד הרקמות לצורך ניתוח דופמין באמצעות HPLC ועיבוד נוסף של החלבון האנדוגני שהשקיע לצורך ניתוח.

בשלב הבא, עיבוד החלבון ששקע לצורך מדידת תכולת החלבון הכוללת מאפשר לקבוע אילו חלבונים מווסתי דופמין או פוספורילציה של חלבונים ניתן למדוד בשילוב עם קריאת תכולת הדופמין ברקמה שבדגימה. בסופו של דבר, ניתוחים של דופמין והחלבונים המווסתים שלו באזורים סומטו-דנדריטיים נפרדים בגוף הביניים מאפשרים להסיק מסקנות לגבי המנגנונים המולקולריים הקשורים לוויסות דופמין.

המונואמינים משפיעים על תוצאות התנהגותיות רבות, ולמעשה חוקרים בתחומי ההתמכרויות, הביולוגיה וליקויים בתנועה, ובמיוחד במחלת פרקינסון, מעוניינים מאוד לדעת כיצד מונואמינים כגון דופמין, אותו אנו חוקרים במעבדה שלי, משפיעים על תוצאות התנהגותיות. עם זאת, החשיבות של חקר המונואמינים עולה עוד יותר כאשר אנו מבינים כיצד הם מווסתים ברמה המולקולרית. היתרון בטכניקה שלנו הוא שניתן להפיק מדגם בודד שהתקבל מרקמת מערכת העצבים המרכזית (CNS) מספר מדדים, כך שנוכל לקבל תמונה מלאה של האופן שבו אירועים מולקולריים משפיעים על חוסר הוויסות של המונואמינים.

ניתן לקחת נתונים אלו ולהציבם בהקשר של האופן שבו ההתנהגות תושפע. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקלו בקשיים, מכיוון שקביעת כמות החלבון והפספורילציה דורשת ידע לגבי כמות החלבון הכולל שתידרש לקבלת קריאה מדויקת, בהתאם לנוגדנים שבחר החוקר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית.

טכניקות הנתיחה וקביעת הממוצעים של המונו יחד עם החלבונים המווסתים הן גישה חדשה יחסית לניתוח ויסות in vivo. כדי להתחיל בהליך זה, קררו מטריצת מוח של מכרסם, צלחת פטרי המכילה חמישה תערים וסכין מנתחים מספר 11 על מצע של קרח רטוב. כמו כן, קררו מראש מספר מבחנות הדרוש לנתיחה על קרח יבש.

לאחר השחיטה של החולדה, הוצא את המוח והנח אותו הפוך, כך שהמוחון הלטרלי יתאים לחריצים במטריקס הקר. לאחר דקה, הכנס את להבי התער הקרים לתוך המוח המקורר, החל מכשנייממטרים באופן רוסטרלי לצומת הראייה (optic chiasm) לצורך ניתוח הסטריאטום וגרעין המבצע (nucleus accumbens). לאחר מכן, המשך להכניס את להבי התער הקרים בכל חתך של מילימטר אחד עד למחצית הפונס; יש להניח את להבי התער באופן מדורג כדי להקל על הוצאתם מהמטריקס.

בעת הוצאת התערים, חפשו את תחילתו של ההיפוקמפוס, שכן הוא המדריך הטוב ביותר להבטחת נוכחות ה-SN וה-VTA במיקום שבו ההיפוקמפוס עוטף לחלוטין את המוח האמצעי. גזרו חתכים בעזרת להב סכין מספר 11 כדי להפריד תחילה את ה-SN מה-VTA. הסירו את הקורטקס ואת ההיפוקמפוס העליונים.

לאחר מכן, בצעו חתך אנכי המפריד בין האזור הפיגמנטי של ה-SN לבין ה-VTA, תוך הקפדה על מגע קבוע של התער על קרח רטוב במהלך הנתיחה. לאחר מכן, בצעו חתך אופקי בקו האמצע או בקרבתו, ממש מעל החלק הדורסלי והלטרלי ביותר של ה-sn. לבסוף, הפרידו בעדינות את ה-SN משאר גזע המוח.

לאחר הסרת ה-SN, הפר את ה-VTA משאר הגוף המרכזי של המוח. העבר את הרקמות המופרדות למבחנות מיקרו-צנטריפוגה שקויררו מראש באופן מיידי. לאחר מכן, אחסן את הרקמות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד העיבוד.

בפרוצדורה זו, הומוגניזרו בעדינות את הרקמה מיד לאחר הוצאתה מקרח יבש, תוך שימוש בתמיסת 0.1 molar per chloric acid EDTA קרה (בטמפרטורת קרח). לאחר מכן, החזירו את הדגימה שוב על קרח יבש. לאחר מכן, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 12,000 RPM לצורך שיקוע.

משקע החלבון ישמש לקביעות ב-western blot, לאחר מכן שאיפה של העל-משקעים אל תוך מבחולת HPLC. יש להניח את משקעי החלבון המשקעים הקפואים, שהתקבלו מטיפול בבופר HPLC, על קרח רטוב להפשרה, ולוודא שכל הבופר הוסר ואורכב. לעיבוד בילטרלי של ה-SN, יש להוסיף למשקע 300 µL של 1% SDS המכיל 5 mM Tris ו-1 mM EDTA ולבצע סוניקציה, בעוד שעבור עיבוד בילטרלי של ה-VTA, 200 µL של 1% SDS יספיקו.

בשלב הבא, הניחו את הדגימות במים רותחים למשך כחמש דקות כדי להשלים את דנטורציה של החלבון. לאחר מכן, הרשו להן להגיע לטמפרטורת החדר, וודאו שהפקקים סגורים היטב בשלב זה. לאחר מכן, השתמשו בבדיקת BCA עם עקומת סטנדרט של חלבון בטווח של 2 עד 40 micrograms של חלבון.

כדי לקבוע את ריכוז החלבון בדגימות בנפח של חמישה מיקרוליטר, השתמש בערך החציוני שהתקבל מניתוח בשלוש חזרות כדי לקבוע את כמות החלבון ביחס לעקומת הסטנדרט. חלק את התוצאה בנפח הדגימה כדי לקבל את ריכוז החלבון. לאחר מכן, במידת הצורך וכפי שמעיד צבע בופר הדגימה, הכן את הדגימות עם בופר דגימה המכיל DIO three etol לצורך אלקטרופורזה רeducing SDS בג'ל אקרילאמיד 10%.

שנו את הצבע לצהוב, הוסיפו tris base בריכוז של 1M ו-pH 8.2 לדגימה במרווחים של 10 µL עד להופעת צבע כחול. כדי להבטיח pH תקין, הריצו את הכמות המתאימה של חלבון כולל באמצעות SDS page על ג'ל acrylamide בריכוז של 10%, ולאחר מכן העבירו את החלבונים לממברנת Nitrocellulose בעלת גודל נקבים של 0.45 micron. הגדירו את מיכל ה-hoffer למתח של לפחות 27 volts והמתינו להשלמת ההעברה במהלך הלילה.

ביום למחרת, ייבשו את הבלוט למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, צבעו אותו בתמיסת poncho S למשך כחמש דקות. לאחר מכן, בצעו דה-סטיינינג (detain) נמרץ בעזרת תמיסת חומצה כלורית 0.2% עד שפסים בודדים של חלבון יבואו לידי ביטוי בבירור והצביעה של הרקע תוסר.

לאחר מכן, השג תמונה של צביעת ה-poncho S באמצעות image J כדי לכמת בהמשך את עומסי החלבון היחסיים בכל נתיב ולנרמל את התוצאות של tyrosine hydroxylase, dopamine transporter, או vesicular monoamine transporter two. כאן מוצג ה-western blot של Syrian 31 phosphorylated tyrosine hydroxylase בדגימות של rat substantial nigra. עקומת הסטנדרט המכוילת של Syrian 31 phosphorylated tyrosine hydroxylase נעה בין 0.3 nanograms ל-2.0 nanograms ונמצאת בטווח הגילוי הליניארי. כאן מוצג ה-western blot של Syrian 40 phosphorylated tyrosine hydroxylase בדגימות rat ventral tegmental.

עקומת הסטנדרט המכוילת של SN 40 phosphorylated tyrosine hydroxylase נעה בין 0.2 nanograms ל-1.5 nanograms ונמצאת בתוך טווח הגילוי הליניארי. שמירה על טמפרטורה נכונה היא חשובה, כמו כן סימון השפופרות. חשוב גם לבצע נורמליזציה לחלבון כדי להפחית את השונות בתוצאות.

פרוטוקול זה, כאשר הוא מבוצע ביסודיות, יכול לספק לחוקרים בתחום התפקוד המוטורי והתנהגות התמכרות מדדים מולקולריים נרחבים המשפיעים על ויסות מונואמינים במוח, ובמיוחד דופמין, שבו אנו מעוניינים. כתוצאה מכך, מדדים אלו יכולים לספק ניתוח מפורט ומקיף של המשמעות עבור תוצאות התנהגותיות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד למקסם את המדדים של ויסות מונואמינים ב-substantial nigra וב-ventral tegmental area מתוך הפרדה בודדת של רקמה.