שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול
18 בדצמבר 2012
הדור והאפיון של תאי T ספציפיים סרטניים באמצעות עכבריים מתואר כאן. רקמה הרתי אדם ותאי גזע hematopoietic מהונדס גנטי אדם מושתלת לעכברי מדוכאי חיסון. התוצאה הוא הכינון מחדש של מערכת חיסון אנושית מהונדסת מאפשרת בבדיקת vivo של תגובות חיסוניות אנטי סרטניות.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לייצר עכברים הנושאים מערכת חיסון אנושית מהונדסת. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת העכבר לניתוח, ולאחר מכן על ידי טעינת ה-trocar בחתיכה של תימוס בשלב השני. Matrigel מעורבב עם תאים שעברו טרנסדוקציה שהם CD 34 negative ו-CD 34 positive, ולאחר מכן התערובת מוספת ל-trocar.
בשלב הבא, מבני המטריג'ל (matrigel) מושתלים תחת קפסולת הכליה. לבסוף, ניתן לנטר את הדחייה של הגידולים המטרה על ידי תאי CD eight T מהונדסים גנטית באמצעות דימות PET חי ומדידות פיזיות של הגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מודלים עצביים מלאים, הוא ששיטה זו מאפשרת לחקור התפתחות של תאי גזע אנושיים שעברו שינוי גנטי בתוך התימוס האנושי, ובדיקת יעילות in vivo עוקבת של השוכות הנגזרות. את ההליך ידגימו שלושה טכנאים מהמעבדות שלנו: Gregory Bristol, Bernard Levin ו-Sean Kim.
בדיאגרמה סכמטית זו, מוצגת מודל ה-BLT המותאם ששימש במחקרים אלו ליצירת עכברים כימריים הנושאים mart-1 T cells ספציפיים. השתבל המבוצע משוחזר מתאי CD34 שעברו טרנסדוקציה ותאים שלא עברו טרנסדוקציה, אשר בודדו מכבד עוברי אוטולוגי. חלק מהתאים שעברו טרנסדוקציה הוקפאו ולאחר מכן הוזרקו לעכברים שהקרינו ארבעה עד שישה שבועות לאחר מכן.
בסרטון זה, מוצגת השתלה של המבנה החי לאחר שהחיות הפכו רפויות בעקבות ההרדמה. התחילו בגילוח הצד השמאלי של כל עכבר, מהירך ועד לכתף, בין מרכז הגב לבטן. לאחר רישום משקלן של כל אחת מהחיות, סמנו את אוזניהם לצורך מספור והזריקו תת-עורית 0.3 milliliters של carprofen לתוך כל אחת מהכתפיים שלהם.
לאחר מכן, הנח את העכברים על צדם הימני כאשר פניהם פונות שמאלה. כעת, שטוף באמצעות PBS את הטרוקאר של מחט להשתלת סרטן בקוטר 16 gauge בעלת קצה שיוף עגול. בעזרת פינצטה בעלת קצה דק, הוסף פיסה של תימוס לצלחת ה-PBS, ולאחר מכן החזק את הטרוקאר במצב אופקי יחד עם המוט.
שאבו את הרקמה ממש בתוך הקצה. החלקת התרוקר תחת קפסולת הכליה והזרקת הרקמה הם מהשלבים המאתגרים ביותר בפרוצדורה זו. כעת, היעזרו בעוזר.
השתמשו בפיפטה בעלת דחיקה חיובית (positive displacement pipette) כדי לערבב 5 µL של Matrigel קר לתוך מבחנה אחת של תאים תוך כדי ערבוב עדין. שמרו על התרוקר (trocar) במצב אופקי. משכו באיטיות את המוט בזמן שהעוזר שואב את ה-Matrigel באמצעות פיפטה.
החדירו את הטרוקר עבור כל עכבר. ראשית, נגבו את העור הגלוי של בעל החיים ב-Betadine ולאחר מכן נגבו אותו בניגב איזופרופנול. קבעו פעמיים את הנקודה הכהה ביותר מתחת לעור, המצביעה על מיקומו של הטחול.
הכליה נמצאת כ-5 מילימטרים גבנית לטחול; השתמשו בפינצטה קהה כדי להרים את העור מעל הכליה. בצעו חתך באורך של כ-15 מילימטרים בעור, במקביל לטחול. בצעו חתך דומה בשכבת שרירי הפריטונאום שמתחתיה.
בזכרים, הכליה צריכה להיות גלויה באופן ישיר. פשוטו לחיצה על הבטן כדי להוציא אותה. כאשר מפעילים לחץ על הבטן עם יד שמאל כדי להשאיר את הכליה חשופה בנקבות, השתמשו תחילה בפינצטה כירורגית (hemostat) כדי לתפוס את השחלה, ולאחר מכן משכו החוצה את הכליה כדי לסייע בשימור האיבר מחוץ לגוף.
צרו חור קטן בקצה האחורי של קפסולת הכליה, ולאחר מכן החליקו את הטרוקר לתוך חור זה ולאורך הכליה, עד שפתח הטרוקר יהיה מכוסה לחלוטין על ידי קפסולת הכליה. לאחר מכן, בעזרת הזרת של יד ימין, דחפו את הרקמה. כעת השתמשו בהמוסטט סגור כדי לדחוף בעדינות את הכליה חזרה למקומה.
קשרו תפר אחד בפריטונאום (peritoneum) באמצעות קשר פעמייים, תוך כיווץ העור כלפי מעלה כמו בכיס משיכה, ולאחר מכן הצמידו אותו באמצעות שני תפסים לפצע. לבסוף, טפטפו טיפה של PBS על כל עין והניחו את העכבר על צדו בתוך כלוב על מצע. לאחר השתלה של כל העכברים באותה הצורה, ודאו שהבעליים חזרו לשכב על גבם לפני השארתם.
איור זה מציג תמונה מייצגת של השתלה חיה של THI בעכברים שהומנסו (humanized mice). באיור זה מוצגים הפיתוח התקין של רקמת הטימוס וההפצה הרקמנית הפיזיולוגית של תאי T חיוביים ל-CD four ו-CD eight אנושיים. בעקבות השחזור, בעלי החיים נושאים מערכת חיסון אנושית עם הפצה תקינה של תאי T חיוביים ל-CD four ו-CD eight.
כאן מוצגת תמונה מייצגת של עכבר הנושא גידול מלנומה. האזורים האפורים מצביעים על תמונת סריקת ה-CT. האזורים הצבעוניים מצביעים על הפעילות המטבולית של הגידול כפי שזוהתה על ידי סריקת ה-PET.
בניסוי זה, סריקת ה-CT לבדה הצביעה על מסה גידולית גדולה באזור המסומן בעיגול הלבן. עם זאת, כפי שמוצג בדימות ה-PET in vivo, אזור זה מורכב בעיקר מרקמה נמקית ומרקמת צלקת, מה שמדגיש את התועלת של דימות PET כדרך רגישה ומדויקת יותר להערכת נסיגת הגידול ופינויו. לאחר הליך זה, ניתן לבצע בדיקות נוספות, כגון פנוטיפ של תאי T ואקטיבציה ex vivo, כדי לענות על שאלות הרלוונטיות לתפקוד תאי T.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את הפקתם ואפיון של תאי T ספציפיים לגידול באמצעות עכברים אנושיים (humanized mice). התהליך כולל השתלה של רקמת תימוס אנושית ותאי גזע המטופואטיים אנושיים שעברו שינוי גנטי לעכברים עם חסר במערכת החיסון, מה שמוביל לשחזור של מערכת חיסון אנושית לצורך בחינת תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות in vivo.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- אונקולוגיה
- רפואה תרגומית
רקע
- מודלים של עכברים המומיזים (Humanized) חיוניים לחקר תגובות חיסוניות אנושיות.
- תאי T שעברו שינוי גנטי יכולים לתקוף גידולים ביעילות.
- ייתכן ששיטות קיימות אינן מדמות באופן מספק אינטראקציות של מערכת החיסון האנושית.
- מחקר זה נועד לשפר את ההבנה של תגובות אנטי-גידוליות.
מטרת המחקר
- ליצירת עכברים בעלי מערכת חיסון אנושית מהונדסת.
- לניטור היעילות של תאי CD8 T מהונדסים גנטית נגד גידולים.
- לספק תובנות לגבי התפתחות תאי גזע אנושיים בתוך הטימוס.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת העכבר להליכים כירורגיים.
- השתלה של רקמת תימוס מעורבבת עם תאים שעברו טרנסדוקציה, שליליים וחיוביים ל-CD34.
- שימוש ב-Matrigel לבניית השתל.
- ניטור דחיית גידול באמצעות דימות PET חי ומדידות פיזיות.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של עכברים בעלי מערכת חיסון אנושית תפקודית.
- ניטור יעיל של דחיית גידול על ידי תאי T מהונדסים.
- הדגמת היתרונות של שיטה זו על פני מודלים קיימים.
- תובנות לגבי התפתחותם של תאי גזע אנושיים in vivo.
מסקנות
- שיטה זו מאפשרת מחקר מתקדם של תגובות חיסוניות אנושיות.
- היא מספקת פלטפורמה לבחינת טיפולים אנטי-גידוליים.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר את ההבנה של הדינמיקה של מערכת החיסון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל העכבר האנושי מסוג BLT מאפשר הערכה ניבוית של טיפולים גנטיים מבוססי תאי גזע ותפקוד של תאי T מהונדסים בהקשר חיסוני אנושי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. פלטפורמה זו ממלאת פער קריטי בשרשראות הפיתוח הפרה-קליניות של אונקולוגיה ואימונותרפיה על ידי תמיכה בהערכה in vivo של התפתחות תאי חיסון אנושיים, התמקדות בגידולים ויעילות טיפולית. שילובה מעלה את הביטחון הטרנסלציונלי ומקטין סיכונים בקבלת החלטות בשלבים מוקדמים עבור תוכניות של טיפול תאי וגנטי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הכוללות תאי מערכת חיסון אנושיים מהונדסים in vivo.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מידול של התפתחות ותפקוד של תאי מערכת חיסון אנושיים.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות עבור קולטני T ספציפיים לגידול.
- משפר את רמת הביטחון בניבוי לצורך קידום אימונותרפיות מבוססות תאים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מערכת in vivo מתוקתקת להערכה כמותית של פעילות אנטי-גידולית.
- מאפשר מדידה הדירה של נסיגת גידול באמצעות דימוי PET חי.
- תומך בסטנדרטיזציה של פנוטיפיקה של תאי מערכת החיסון ובדיקות תפקודיות לאחר השתחלה.
- מכין פלטפורמה חסונה להערכת טיפולים בתאים שעברו מודיפיקציה גנטית לפני מעבר לשלב הקליני.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם אינטראקציות חיסוניות-גידול רלוונטיות לבני אדם עבור גילוי סמנים ביולוגיים (biomarkers) טרנסלציונליים.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של טיפולים בתאי חיסון מהונדסים.
- תומך בהקדמה מותאמת סיכונים על ידי אספקת נתונים מכניסטיים ונתוני יעילות in vivo.
- מאפשר הערכה של סילוק גידולים והישרדות תאי חיסון בהקשר אנושי (humanized context).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מודל זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים, זיהוי המולקולות המובילות (lead identification) ותיקוף פרה-קליני עבור מועמדים לטיפולים תאיים וגנטיים המכוונים לסרטן ולהפרעות חיסוניות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקוד של תאי T מהונדסים ומיקוד לגידול in vivo.
- סריקה: מספק פלטי דימות PET כמותיים הניתנים לשחזור ותוצאות מדידת גידולים לצורך הערכת מועמדים.
- אנליטיקה: מספק תוצאות מהימנות לפנוטיפיקה של תאי חיסון והערכה תפקודית לאחר השתּלה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין נתוני יעילות in vivo לבין סממנים ביולוגיים ונקודות קצה מכניסטיות הרלוונטיות לתרגום קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לבדיקה איטרטיבית של טיפולים בתאי חיסון שעברו שינוי גנטי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בפיתוח טיפולים בתאי מערכת החיסון.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות יעילות in vivo ותמיכה בזרימות עבודה ניתנות לשכפול ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום נכסי טיפול תאי וגנטי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במניפולציה של תאי גזע אנושיים ובניתוחים בעכברים עם חסר חיסוני.
- דורש גישה לדימות PET ותשתיות מתקדמות להחזקת בעלי חיים.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך הדירות והשוואת נתונים.
- חייבים להתאים את הפרוטוקולים למודלים שונים של גידולים ולאסטרטגיות שונות של שינוי גנטי לפי הצורך.
- מטיל דרישות בטיחות ביולוגית ורווחת בעלי חיים עקב שימוש ברקמות אנושיות ובמארחים עם מערכת חיסון מדוכאת.
