נוהל אופטימליים עבור Fluorescence המופעל בידוד מיון (FACS) תא של אבות עצביות האוטונומית מאיברים בטן של עכברים עוברית
17 באוגוסט 2012
הליך אופטימיזציה לטהר עצביים לפסגה הנגזרות אבות עצביים מרקמות העכבר העובר מתוארת. שיטה זו מנצלת את הביטוי של אללים הכתב ניאון לבודד אוכלוסיות נפרדות על ידי מיון הקרינה המופעל תאים (FACS). הטכניקה ניתן ליישם על מנת לבודד subpopulations עצביים לאורך ההתפתחות או ברקמות בוגרים.
המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק אוכלוסייה של תאי מוצא עצביים (neuronal progenitors) מטוהרים מגנגליונים של מערכת העצבים ההיקפית. הדבר מושג תחילה על ידי נתיחה של האיבר או של הגנגליונים הספציפיים הרלוונטיים מעכברים עובריים. לאחר מכן, הרקמות עוברות דיסוציאציה חלקית כדי לשחרר את התאים הבודדים אל המצע הסביבתי.
בשלב הבא, תרחיף התאים מסונן כדי להסיר גושים של רקמה שנותרו או אגרגטים גדולים. לבסוף, תרחיף התאים עובר מיון באמצעות זרימה (flow sorted) כדי לבודד את האוכלוסייה הרצויה על בסיס ביטוי של רפורטר פלואורסצנטי באוכלוסיית תאים זו. בסופו של דבר, ניתן להשוות דפוסי ביטוי גנים בין תאי אב, שבודדו בשלבים שונים של ההתפתחות, או בין אוכלוסיות מזוקקות של סוגי תאי עצב שונים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני בידוד של אוכלוסיות תאים המבוסס על סימון בנוגדנים הוא שבמקרים רבים רכיבי אימונו-סימון אינם זמינים. קווי עכברים מהונדסים גנטית, המייצרים חלבון פלואורסצנטי בתתי-קבוצות ניורוניות מובחנות, מאפשרים את בידודן של אוכלוסיות תאים אלו המבטאות גן מסוים. בעוד שאנו מדגימים שיטה זו לבידוד של תאי מוצא עצביים מהמעי וממסלול הנוירוגנזה של הפה, ניתן להחיל אותה גם על מערכות מודל אחרות המבטאות רפורטרים פלואורסצנטיים.
בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם נוטים לעיכול יתר של רקמות המקור, מה שמוביל לאובדן חיוניות התאים. לפני תחילת הדיסקציה, יש לבחון את העוברים תחת תאורה בשדה בהיר (brightfield) כדי לוודא שהמבנים הרלוונטיים נמצאים במיקוד. לאחר מכן, זהו את העוברים החיוביים לטרנסגן על ידי סריקה של ביטוי הד reporter הפלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי.
לאחר ההמתה, מתחילים את העבודה עם העוברים על ידי הוספת כמות מינימלית של PBS לצלוחית הניתוח, כדי שהעובר לא יצוף בזמן הפרדת הרקמות. פתחו את עור העובר לאורך צדי הגוף וברוחב הבטן בגובה הכבד. גלגלו את העובר על גבו והשתמשו בפינצטה עדינה כדי להקבעו במקומו.
בגובה הגפיים הקדמיות, הכניסו זוג פינצטות נוסף בגובה הסרעפת, ולאחר מכן משכו במהירות את האיברים הפנימיים כלפי מטה לכיוון הזנב והרחיקו אותם מדופן הגוף הגבית, כדי להסיר את האיברים הפנימיים מהכבד ועד הפטמה הגניטלית (genital tubercle). אם איברים מחלל בית החזה, כגון הלב או הריאות, יוצאים כשהם מחוברים לאיברים הפנימיים, הסירו אותם לפני שתמשיכו הלאה.
לאחר הפרדת אישכי המבטן מהגופה, הכניסו פינצטה מתחת לכבד, סמוך לקיבה, והפרידו בעדינות את הכבד מהמעי. לאחר מכן, בצעו דיסקציה זהירה של המעי האחורי מהשופכה הגבית והסִירו את המעי ממערכת השתן והמין. לבסוף, הפכו את המעי כך שהטחול יהיה גלוי מתחת לקיבה.
הסר את הטחול ואת הלבלב. הרחק את לולאות המעי זו מזו על ידי אחיזה במזנטריון (קרום הבטן). לאחר מכן, הסר את המזנטריון ואת כלי הדם הנלווים מהמעי על ידי משיכה עדינה של המזנטריון.
הימנעו מאחיזה ישירה של המעי באמצעות הפורספס. אם המעי נקרע, פשוט אספו את החלקים הנפרדים לשלב הדיסוציאציה. רכזו כל סוג רקמה יחד במבחנה קונית של 15 milliliter המכילה HBSS קר בקרח, בהתאם לסוג הרקמה ולפנוטיפ של העובר.
לאחר השקיעה (pelleting), יש לשאוב מהרקמות שחולקו את מרבית ה-HBSS. לאחר מכן, יש לערבב מחדש את משקע הרקמה ב-1 עד מספר מיליליטרים של ACU max. יש להחליף קצות פיפטה בין כל דגימה.
כדי למנוע זיהום צולב של סוגי רקמות, הניחו את המבחנות במסבך מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 עד 45 דקות. בהתאם לשלב של בידוד הרקמה, הדיסוציאציה והסינון של הרקמה הם החלקים המורכבים ביותר בפרוצדורה, וזאת כדי למנוע דיסוציאציה מוגברת של הרקמה, וכתוצאה מכך, חיוניות תאים נמוכה.
הגבילו את זמן הדיסוציאציה ואל תנסו לפרק לחלוטין את כל חתיכות הרקמה באמצע התהליך. ובסיום זמן הדיסוציאציה, פרקו את הרקמה ידנית על ידי הכתקה נמרצת של המבחנה לדופן אמבט המים ותנועת שורש כף יד מהירה כלפי מטה. כעת העבירו את הדגימות שעברו דיסוציאציה לקרח והוסיפו מיד 1 mL של תמיסת quench שהוכנה טריאית לכל מבחנה, תוך שימוש בקצה פפטה חדש עבור כל דגימה, וערבבו את הדגימה מעלה ומטה עד שהרקמה תהיה כמעט מפורקת לחלוטין.
כעת, בעזרת זוג פינצטות שעבדו סטריליזציה באתנול, הניחו ריבוע של 3 ס"מ של ממברנת רשת ניילון בעובי 38 מיקרון מעל פיית מבחנה קונית חדשה בנפח 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמשו בטיפים בעלי קוטר צר כדי לסנן את תמיסת התאים העיקרית שהושחתו דרך הרשת, על ידי פיפטור למרכז הממברנה. לאחר סינון תמיסתו של התאים, שטפו את מבחנת הדגימה עם 1 מיליליטר של quench one to five וסננו את התאים הנותרים.
לאחר מכן, הסירו את הממברנה תוך הקפדה למנוע מדגימות רקמה שלא סוננו להיכנס לשפופרת. לאחר שקיעת התאים, שאבו את העליון ותלו את המשקע במיליליטר אחד של quench 1:5. לאחר מכן, סננו כל תרחיף תאים דרך רשת ניילון לתוך שפופרות פוליסטירן של 5 מיליליטר כפי שהודגם.
התחילו בהפרשת אליקווט קטן מדגימת הפלואורסצנציה עבור בקרת הפיצוי (compensation control) עבור EGFP בלבד. לאחר מכן, חלקו את דגימת הרקמה של סוג הבר (wild type) לשני חלקים, כאשר אחד יסומן כסוג בר בלבד והשני כ-seven A a d.Only. כעת, מלאו את כל מבחנות הדגימה ב-quench one to five, ולאחר סבסוב (pelleting) של הדגימות, שאבו את כל העל-נוזל (supernatant) מלבד 200 µL האחרונים בכל מבחנה.
לבסוף, הוסיפו 7-AAD לדגימות המיועדות למיון ולביקורת ה-7-AAD בלבד. לאחר מכן, הוסיפו 0.75 מיליליטר של triazole LS למבחנות איסוף דגימות מסוג מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. התחילו בשימוש בדגימות הביקורת כדי לקבוע את פרמטרי הפיצוי (compensation) והשערים (gates), על מנת להשמיע תאים מתים חיוביים ל-7-AAD ולאסוף תאים המראים עוצמה גבוהה של פלואורסצנציית GFP.
לאחר קביעת פרמטרי הפיצוי, התחילו במיון בלחץ הנמוך ביותר האפשרי עם נחיר רחב וקצב זרימה נמוך. אספו מקסימום 25,000 תאים לתוך כל מבחנה מיקרו-צנטריפוגה, כדי שה-triol LS לא ייהיה מדולל מדי. מיד לאחר המיון, ערבלו בוורטקס (vortex) כל מבחנה של תאים שנלכדו ב-triol ls.
בדמות הראשונה מוצגת מערכת רבייה פנימית של נקבת עכבר (Euro) במיפוי מלא, 15.5 ימים לאחר ההפריה, במבט ונטראלי תחת תאורה בשדה בהיר. אותה דגימה מוצגת תחת תאורת פלואורסצנציה כדי להדגים את התפוצה של תאים חיוביים ל-EGFP באדרנל ובגנגליון הצליאק הממוקם מדיאלית, כפי שזוהו על ידי ביטוי הגן הטרנסגני TH EGFP. מבט לטראלי זה של שלפוחית שתן שנשלה באופן חלקי מ-עכבר TH EGFP ביום ה-15.5 לאחר ההפריה מראה פלואורסצנציה מביטוי הגן הטרנסגני בגנגליונים הפלביים, בדופן שלפוחית השתן ובשופחלקה.
במבט גבי זה של אותם תאים חיוביים ל-EGFP, ניתן לראות בבירור את רקמת השופכה הגבית הקדמית. פירוק רקמות כדי להפיק תרחיפי תאים למיון באמצעות זרימה (flow sorting) הוא איזון עדין בין עיכול אנזימטי מספיק לבין מניעת עיכול יתר, שעלול להוביל לשבירות גבוהה של התאים. מיקרוגרפיה זו מציגה רקמות של דרכי השתן התחתונות ושל המעי בחציו של זמן הפירוק. כפי שניתן לראות בתמונות אלו של רקמה שעוכלה כראוי, לפני ואחרי פירוק ידני, חתיכות קטנות של איברים שפוּרקו עדיין נראות בבירור ברקמות שעובדו אנזימטית זמן רב מדי או בריכוז גבוה מדי של אנזים.
עם זאת, התוך המוּתָר כעת אינו מכיל שרידי רקמה גדולים; דיסוציאציה הולמת וסינון ידני מניבים פרופילים של ציטומטריה זרימתית המראים בדרך כלל יותר מ-90% תאים חיים, ובקרב התאים המבטאים את השומן (reporter) באוכלוסיית התאים החיים זו, התאים שומרים על ביטוי EGFP בעוצמה גבוהה. האוכלוסייה השחורה מורכבת מתאים בודדים שמתו שסומנו על ידי ספיגת צבע הפלואורסצנציה 7-AAD. האוכלוסייה האפורה מורכבת מתאי סינגלט, על בסיס פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צידי (side scatter), אשר לא ספגו 7-AAD, ולכן הם חיים.
האוכלוסייה הירוקה מגיעה מהאזור המוגדר כחיובי ל-GFP ומורכבת מתאים בודדים חיוניים שהוצאו מהמיון שבע פעמים, ואשר מראים פלואורסצנציית EGFP. באמצעות הליך זה, ניתן לבצע בידוד של תאי מוצא עצביים (neuronal progenitors) מרקמות פריפריאליות אחרות, כגון השירשראת הסימפתטית, השורש הגבי, הגנגליונים או הריאות, על מנת לענות על שאלות הנוגעות להבדלים בפרופילי ביטוי הגנים בין אוכלוסיות שונות או על התפתחותן של שורות תאים (lineages) נפרדות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה מותאמת לניקוי תאי אב עצביים ממקור רב-עצבי (neural crest) מרקמות של עוברי עכבר. השיטה עושה שימוש במיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) כדי לבודד אוכלוסיות ספציפיות על בסיס ביטוי של רפורטר פלואורסצנטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- פרוגניטורים נוירונליים הם קריטיים להבנת התפתחות מערכת העצבים.
- בידוד של אוכלוסיות נוירונליות ספציפיות מסייע בחקר דפוסי ביטוי גנים.
- אללים של רפורטרים פלואורסצנטיים מספקים שיטה למיון תאים מדויק.
- רקמות של עוברי עכבר משמשות כמודל לחקר התפתחות מערכת העצבים ההיקפית.
מטרת המחקר
- להשיג תאי פרוגניטור עצביים מטוהרים מגנגליונים של מערכת העצבים הפריפריאלית.
- להקל על השוואות של ביטוי גנים בין אוכלוסיות עצביות שונות.
- לאפשר את חקר ההתפתחות העצבית בשלבים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ה diseקציה של גנגליונים ספציפיים מעכברי עובר.
- דיסוציאציה חלקית של רקמות להשגת תרחיף תאים.
- סינון של תרחיף התאים להסרת גושים ואגרגטים.
- מיון באמצעות זרימה (Flow sorting) על בסיס ביטוי של רפורטר פלואורסצנטי לבידוד אוכלוסיות מטרה.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של אוכלוסיות של תאי מקור עצביים (neuronal progenitor populations).
- יכולת להשוות דפוסי ביטוי גנים בין שלבי התפתחות שונים.
- בידוד של סוגי תאים עצביים נרחשים למחקר המשך.
- הדגמה של יעילות ה-FACS במחקר של תאי מקור עצביים.
מסקנות
- השיטה המתוארת מספקת גישה מהימנה לבידוד של תאי פרוגניטורים עצביים.
- טכניקה זו יכולה לשפר את הבנתנו לגבי ההתפתחות והתפקוד העצבי.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על שיטה זו כדי לחקור היבטים שונים של הנוירוביולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד של אוכלוסיות נדירות של תאי אב עצביים מרקמות עובריות מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות (target validation), על ידי אספקת מערכת מנוקה לבדיקת ביטוי גנים והחלטות גורל תאי (lineage commitment). גישה זו, המבוססת על FACS, תומכת בביטחון חיזוי במודלים פרה-קליניים באמצעות הפקת תאים חיוניים לבדיקות תפקודיות המשך, ובכך מפחיתה עמימות במחקרי מעורבות מטרה (target engagement). השיטה משפרת את הרציפות התרגומית משלב הגילוי ועד לזיהוי מוביל (lead identification), על ידי אספקת תשומות תאיות סטנדרטיות המוגדרות על ידי גנים מדליים (reporters) עבור קמפיינים של סריקה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של תוכניות שעתוק בתאי מוצא עצביים מסוג TH+ לצורך תיקוף של מטרות במערכת העצבים האוטונומית.
- ערך תפעולי: מספק סבב עבודה הדיסוציאציה ומיון הניתן לשחזור, השומר על חיות תאים של יותר מ-70% עבור תשומות ניסיוניות עקביות.
- ערך ניבוי: תומך באפיון תפקודי של שושלות קטכולאמינרגיות להפחתת סיכונים במטרות המעורבות בתגובה למצבי לחץ ובויסות קרדיווסקולרי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר אוכלוסיות מטוהרות של תאי פרוגניטור TH+ המתאימות לסריקת תרכובות בוויסות של מסלולים אוטונומיים.
- ערך תפעולי: מספק תרחיפי תאים סטנדרטיים עם כמות נמוכה של שברים ודיוק גבוה של חלבון הדגל (reporter) לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- יכולת הרחבה: תואם לעיבוד של רקמות מרובות (מעי, LUT), מה שמאפשר סריקה מקבילה במודלים התפתחותיים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר השוואה של ביטוי גנים לאורך שלבי התפתחות כדי לזהות סממנים ביולוגיים (biomarkers) ספציפיים לשלב.
- ערך תפעולי: מספק תאים חיוניים לבדיקות אלקטרופיזיולוגיה או מחקרי השתלה להערכת הבשלה תפקודית.
- הלימה תרגומית: תומך במידול רלוונטי למחלות של neurocristopathies ונוירופתיות אנטריות באמצעות בידוד מוגדר של תאי פרוגניטור.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לאופטימיזציה של מובילים (lead optimization), על ידי אספקת מערכת תאית מוגדרת למעקב מכניסטי לאחר זיהוי פגיעות (hits) ראשוניות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהבהרת מסלולים בפיתוח מערכת העצבים האוטונומית באמצעות פרופיל של תאי פרוגניטור מבודדים.
- סריקה: מאפשר הכנה של אוכלוסיות נוירונליות סטנדרטיות לסריקת ספריות תרכובות לצורך מודולציה של GPCR או תעלות יונים.
- אנליזה: מספק קריאות כמותיות של פלואורסצנציה וחיוניות להשוואת יעילות הבידוד בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים של פרוגניטורים עובריים לבין תפקוד אוטונומי לאחר הלידה באמצעות אנליזה אורך של ביטוי גנים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך FACS הניתן לשימוש חוזר לבידוד של אוכלוסיות נוירונליות מרובות המסומנות פלואורסצנטית לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי מתן אפשרות להשוואה ישירה של אוכלוסיות נוירונליות איזוגניות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרמטרי הפירוק והמיון של הרקמה לשיפור השחזוריות בין אתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי אספקת נתונים תפקודיים מוקדמים על שושלות המבטאות את המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של מטרות אוטונומיות בהתבסס על נגישות למטריקה של תאי אב והיתכנות טיפולית (druggability).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמות עובריות ובמיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS).
- תלוי בגישה לממיין תאים (cell sorter) בעל יכולת התזה בלחץ נמוך ובריאגנט הפירוק Accumax.
- דורש שלבי כיבוי (quenching) וסינון סטנדרטיים כדי למנוע סתימה ולשמר את החיוניות.
- נדרשת התאמה של תזמון הדיסוציאציה בהתאם לבשלות הרקמה ולרגישות האנזימטית.
- מוגבל על ידי הזמינות של קווי דגמי דוחיות (reporter lines) טרנסגניים לסוגי תאי עצב ספציפיים.
