Heterotypic תלת ממדי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא ליצור מודלים טיפוסיים תלת-ממדיים של שלבים מוקדמים בהתפתחות סרטן השחלה. ראשית, יש להפיק שורות תאים מומינרליים H turt הנגזרים מרקמות אפיתליאליות ופיברובלסטיות נורמליות ראשוניות של השחלה. לאחר מכן, כדי לשחזר את הארכיטקטורה in vivo ואת האינטראקציות התאיות המורכבות הקיימות בשחלה, יש לבצע תרבית משותפת של שורות תאים אפיתליאליות וסטרומליות במודלים תלת-ממדיים של ספרואידים (S spheroid). לבסוף, יש לקבע ולצבוע את תרביות האורגנואידים ולנתח את הביטוי של סממנים ספציפיים במטרה לחקור מאפיינים מולקולריים של אינטראקציות בין הסטרומה לאפיתל.

התוצאות שהתקבלו מראות כיצד שינויים במרכיב תאי הסטרומה של מודלים טיפוסיים בתלת-ממד יכולים להשפיע על הפנוטיפ של תאי אפיתל המגודלים בקו-קלטורה. מודלים טיפוסיים בתלת-ממד יכולים לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום המחקר של סרטן השחלה, כגון חקירת מקורי המחלה והבהרת תפקידו של המיקרו-סביבה הסטרומלית בהיווצרות ובפיתוח הגידול. יישומי טכניקות אלו פה רחבים יותר לעבר אבחון המחלה וטיפולה בהשוואה לשיטות גידול אחרות בתלת-ממד.

ניתן להחיל טכניקה זו על מגוון רחב יותר של נפחי תרביות תאים ועל יישומים המשכיים. לדוגמה, ניתן להשתמש בתרביות תלת-ממדיות הומוגניות וטיפיות לבדיקת תרופות in vitro. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על מערכות מודל אחרות, כגון במחקר של סוגים אחרים של גידולי ממס או במחלות שפירות.

העבירו את רקמת השחלה הטריה למעבדה לתרבית תאים בתוך מצע גידול לפיברובלסטים נורמליים מו अमरליזים של השחלה, בתוספת אנטיביוטיקה ואנטימיקוטים נוספים. שטפו את הדגימה שלוש פעמים עם 5 mL של PBS כדי להסיר תאים אפיתליאליים שנותרו מחוברים באופן רפוי לרקמה. לאחר מכן, העבירו את הדגימה יחד עם ה-PBS לכלי תרבית P 100 נקי. באמצעות מכשירים סטריליים, העבירו את הרקמה לכלי תרבית P 100 נקי ויבש שני.

חתוך את הרקמה לחתיכות של 0.5 סמ"ר והעבר כל חתיכה לצלוחית P 100 נפרדת. המשך לחתוך את הרקמה לחתיכות שגודלן פחות ממילימטר רבוע אחד. לאחר מכן, הוסף 20 milliliters של מצע INOF GM והעבר לתרבית. עקוב אחר צמיחת התאים באמצעות מיקרוסקופיית פאזה.

יש לוודא שהתאים נצמדים לצלחת תוך 24 שעות. יש לעקוב אחר צמיחת התאים באמצעות מיקרוסקופיית פאזה. התאים בדרך כלל נצמדים לצלחת תוך 24 שעות. לאחר שבוע, יש להסיר רקמות שאינן צמודות באמצעות שאיבה, להשלים את המצע ולאחר מכן להזין מחדש את התרביות פעמיים בשבוע במשך שבוע עד שלושה שבועות, כאשר מושבות התאים הן בגודל של כ-500 microns.

בודדו את השיבוטים באמצעות טריפסין ודיסקי שיבוט מצופים. כדי לאשר כי התאים הם 100% פיברובלסטיים, זרעו דגימה של שלב התאים על כיסויי זכוכית ובצעו צביעה אימונופלואורסצנטית עבור סמן פיברובלסטי, סמן אפיתליאלי וסמן לתאי אנדותל.

יום אחד לפני טרנסדוקציה רטרוביראלית של מעבר H Turt, העבירו את בידודי תאי הפיברובלסטים השחלאיים הנורמליים מצלחת P 100 אחת לשלוש צלחות P 100. ניתן לרכוש על-נוזל ויראלי מוכן מראש או להפיקו במעבדה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לטרנספקציה משולבת של תאי HEC 2 9 3 T. להכנת תמיסת poly Hema, שקלו 1.5 גרם poly hema והניחו בבקבוק סטרילי.

הוסיפו 95 milliliters של אתנול מוחלט בדרגת ביולוגיה מולקולרית, וחמישה milliliters של מים מזוקקים בדרגת תרבית תאים. הניחו את תמיסת ה-poly Hema במקלח מים בטמפרטורה של 65 °C עד להמסה מלאה. צפו את צלחות תרבית הרקמות בתמיסת poly Hema שהוכנה טרייה.

ייבשו את צלחות תרבית התאים באוויר בתוך תא זרימה למינרית. ניתן להשתמש בטלטול עדין על גבי פלטפורמת טלטול כדי להבטיח ציפוי אחיד של בקבוקונים או צלחות בגודל גדול יותר. אם תמיסת ה-polyus תתייבש מהר מדי, פני השטח לא יהיו חלקים.

במידת הצורך, ניתן לבצע טיפול מקדים בפיברובלסטים לפני הגידול בתרבית תלת-ממדית; לדוגמה, להשראת סנצנסיות (הזדקנות תאית), טפלו בתאים במינונים תת-קטלניים של מי חמצן. השקימו והרחיבו את תרביות תאי ה-INOF והתאים האפיתליאליים in vitro כדי להכין מספיק תאים להקמת סטרואידים הטרוטופיים תלת-ממדיים. לאחר שטיפה של חמש דקות ב-PBS, הוסיפו 15 milliliters של מצע לצלחת ה-poly hema.

בינתיים, הוסיפו trypsin לתאי פיברובלסטים שחלתיים נורמליים של השחלה כדי להפרידם מהצלחת התרבית. לאחר שלוש עד חמש דקות, נטרלו את ה-trypsin עם נפח שווה של מצע גידול ואספו את התאים באמצעות סנטריפוגה. השאיבו מחדש את משקע התאים ב-5 mL מצע וערבבו היטב באמצעות פיפוט מעלה ומטה או ערבוב עדין ב-vortex.

לאחר מכן, השתמשו בדגימה של 10 µL כדי לספור תאים חיוניים באמצעות trypan blue. כעת, הוסיפו 4 מיליון תאי INOF למדיום שכבר הועבר לצלחת המצופה ב-poly hema. השלימו את נפח מצע התרבית ל-20 mL והדגרירו בטמפרטורה של 37 °C, 5% carbon dioxide.

עקבו אחר האגרגציה התאית לספרואיד רב-תאי באמצעות מיקרוסקופיית פאזה כדי להזין מחדש את תרביות הספרואידים כל יומיים עד שלושה ימים. הניחו את הפלטות בזווית על גבי פיפטה. המתינו עד שהספרואידים ישקעו והסִירו בזהירות כ-16 milliliters של המצע המרוקן באמצעות פיפטה של 5 milliliters.

הוסיפו 16 מיליליטר של מצע רענן לתרבית והחזירו למדגרה ביום השביעי. צרו תרביות הטרוטיפיות על ידי הוספת תאי אפיתל לפיברובלסטים. ראשית, הכינו סספנסיות של תאי אפיתל שחלאות באמצעות טריפסין כפי שמתואר קודם לכן, לאחר ספירת התאים.

שטפו פעם אחת במדיום INOF GM כדי למנוע מעבר של גורמי גדילה ממדיום הגדילה של התאים האפיתליאליים. לאחר חידוש המדיום של תרביות ה-OID של הפיברובלסטים, הוסיפו את התאים האפיתליאליים ביחס של ארבעה פיברובלסטים לכל תא אפיתליאלי. את ה-OIDs ההטרוטופיים במדיום INOF GM מאכילים באופן טיפוסי כל יומיים עד שלושה ימים למשך 14 ימים נוספים.

עבור אימונוהיסטוכימיה, קבעו את ה-PHE באמצעות פורמלין בניטרול באפר, השקיעו את ה-PHE והחליפו את הפורמלין ב-70% ethanol. המשיכו בעיבוד לפאראפין תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים המשמשים לרקמות אנוש. ניתן לחתוך סטרואידים המוטמעים בפאראפין ולצבוע אותם ב-h and e או בסממנים מולקולריים ספציפיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

לחילופין, יש לשטוף את הסטרואידים ב-PBS ולקבע ב-4% para formaldehyde. לאחר מכן, יש להטמיע את הדגימות במדיום OCT ולהקפיא במהירות (snap freeze) לצורך חיתוך בקריוסטט וצביעה אימונופלואורסצנטית להערכה באמצעות זרימה ציטומטרית (flow cytometry). שטפו את הסטרואידים ב-PBS ובצעו דיסוציאציה באמצעות עיכול בטריפסין או ב-Accutane בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

ניתן לקדם דיסוציאציה מלאה של סטרואידים לסספנסיה של תאים בודדים על ידי פיפטינג של התמיסה מעלה ומטה באמצעות טיפ פיפטה של מיליליטר אחד. יש להיזהר לא לפגוע בתאים. נטרלו את התגובה עם נפח שווה של מצע תרבית והסירו גושים של תאים על ידי העברת הסספנסיה דרך מסננת תאים של 40 עד 70 מיקרון. לאחר מכן, השקיעו את התאים, שטפו עם PBS וספרו אותם; השביעו מחדש את מספר התאים הרצוי בבופר FACS וצבעו בהתאם להוראות היצרן. במעבדה שלנו, השגנו תאי אפיתל שחלה שעברו טרנספורמציה חלקית, וביצענו אותם בתרבית משותפת (co-culture) עם פיברובלאסטים של שחלה נורמליים ובעלי גיל תאי (senescent) כדי לדמות התפתחות של סרטן שחלה בשלב מוקדם.

בשחלה של אישה לפני גיל menopause, צביעה אימונופלואורסצנטית של פיברובלסטים שחלאיים נורמליים מהונחים (immortalized) מראה כי הן פיברובלסטים שחלאיים נורמליים ראשוניים והן פיברובלסטים שחלאיים נורמליים מהונחים מבטאים חלבון ספציפי לפיברובלסטים, אך אינם מבטאים cytokeratin seven ומבטאים vimentin. תאי פיברובלסט שחלאיים נורמליים שגודלו לבדם במבנה תלת-ממדי (3D) מראים מורפולוגיה של צורת כישOMe (spindled) ומטריצה חוץ-תאית שופעת. במחקר זה, פיברובלסטים שחלאיים נורמליים נחשפו למימן פéroקסיד כדי להשרות סנסקנס (הזדקנות תאית) לאורך שבעה ימים, ולאחר מכן גודלו יחד עם תאי אפיתל שחלאיים שעברו טרנספורמציה חלקית למשך 14 ימים.

כדי להבחין בין שני סוגי התאים, הסטרואידים שהתקבלו נצבעו אימונו-היסטוכימית עבור mim one כסמן לשגשוג ועבור pan cytokeratin כסמן אפיתליאלי. כימות הנתונים מעלה כי הסביבה המיקרוסקופית המזדקנת מקדמת מאפיינים נאופלסטיים של תאים אפיתליאליים שעברו טרנספורמציה חלקית, בעוד שסביבה מיקרוסקופית נורמלית מעכבת התקדמות נאופלסטית; מאפיינים היסטולוגיים של תאים נורמליים וממאירים, שאינם ניתנים לזיהוי כאשר התאים גדלים כשכבה אחת (monolayers), שוחזרים. כאשר התאים מועברים לתרבית ספרואידית, למשל, ניתן לזהות מאפיינים היסטולוגיים של סרטני שחלה מסוג תאים בהירים בתרביות תלת-ממדיות של שורות תאים של סרטן שחלה מסוג תאים בהירים, אך לא בתרביות שכבה אחת של אותם תאים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מקריאים תרביות תלת-ממדיות טיפוסיות למחקר של האינטראקציות בין תאי אפיתל לתאי סטרומה במהלך השלבים המוקדמים של התפתחות הגידול. בעת הקמת תרבית תלת-ממדית, חשוב להתאים את מספר התאים בהתאם ליישום הבא בתהליך, תוך התחשבויות באובדן מסוים של חומר במהלך העיבוד.

ברגע שהשיטה תשלט, ניתן להקים תרביות תלת-ממד (3D) תוך שעה אחת בהתאם לנוהל זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ציטומטריה של זרימה בשילוב עם פרופיל מיקרו-מערך של ביטוי גנים, כדי לנתח את השינויים הגלובליים בביטוי הגנים המתרחשים בתרביות טיפוסיות תלת-ממדיות אך אינם מזוהים בתנאי תרבית של שכבה אחת (monolayer). דבר זה יאפשר ניתוח של מסלולי האיתות הדו-כיווניים המתרחשים באופן ספציפי תחת מיקרו-סביבה של תרבית ליבה תלת-ממדית.