גישת עיבוד מקביל רב היעד לקביעת גנטי למבנה של פולימראז שפעת PB2 מקטע

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בגישה של מספר מטרות לקביעה מבנית של חלבון מטרה באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני X, החל מגן בודד או רצף גנטי בודד במקרה המוצג כאן. חלבון המטרה הוא תת-היחידה PB2 של הפולימרז משפעת A, רכיב מפתח בשכפול נגיפי. גישת מספר המטרות מושגת תחילה על ידי עיצוב ושבט של סדרה של מבנים גנטיים במקביל, בהתבסס על רצף המטרה הבודד ומידע נוסף הידוע על החלבון.

השלב השני הוא בדיקת רמות הביטוי עבור כל מבנה (construct) ובחירת המבנים הטובים ביותר לביטוי חלבון בקנה מידה גדול בתרבית תאים. השלב הבא דורש פירוק של התאים כדי להפריד את חלבוני המטרה מחומר הביטוי וזיקוק של כל אחד מהם לרמה גבוהה מאוד של טוהר. לאחר מכן, מקימים סדרת ניסויי גבישה עם כל חלבון כדי להשיג צורת גביש המתאימה למחקרי x-ray.

לאחר מכן נאספים נתוני עקיפת קרני רנטגן (X-ray diffraction) ברזולוציה גבוהה מאחד או יותר גבישים, והם משמשים לפתרון וזיקוק של מפת צפיפות אלקטרונים המתווה את המבנה של כל חלבון מטרה. תוצאות אלו מאפשרות יצירת מבנה תלת-ממדי של חלבון המטרה בהתבסס על מפת צפיפות האלקטרונים. עיבוד של מספר מטרות במקביל מגדיל משמעותית את סיכויי ההצלחה בקביעת המבנה על ידי אספקת חלופות רלוונטיות בכל נקודת תקיעה פוטנציאלית בנתיב העבודה.

עבודה על מספר מטרות במקביל היא יעילה מאוד, ומפחיתה את הזמן והעלות עבור כל חלבון בכל שלב. הפוטנציאל להגברת הקצב שבו מושלם קביעת המבנה עבור מטרות הניתנות לטיפול תרופתי יאפשר יותר הזדמנויות לפיתוח טיפולים בכל שנה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות בעלות ערך בביולוגיה מבנית, החלבון באיכות גבוהה המתקבל באמצעות שיטות אלו יכול לתמוך בכל מחקר המבוסס על חלבונים.

לכל שלב בתהליך יש מדע משלו והוא דורש מומחיות ייחודית, אך ההשקעה באנשים, במיכשור ובבידע מקצועי עשויה להשתלם מאוד ברגע שכל החלקים יורכבו. ברגע שנבחרו גן מטרה ומוצר גן לבדיקה, השלב הראשון דורש תכנון של מספר וריאנטים גנטיים או קונסטרוקטים. תוכנת Gene composer משמשת לתכנון קונסטרוקטים אלו ברמת החלבון, יחד עם הקוד המשויך ברצפי גנים סינתטיים מהונדסים.

באמצעות מודול תצוגת היישור (alignment viewer) ומודול תכנון הקונסטרקט (construct design), השוו יישורי רצפי חלבונים והגדירו עבור תכנון קונסטרקט החלבון את הפריימרים התמידיים (terminal primers) או האמפרים (ampers) עבור ה-PCR של המבוא (insert PCR) וה-PCR של הווקטור (vector PCR). לאחר מכן, השתמשו באלגוריתם המרה מחלבון ל-DNA של ה-gene composer כדי לתרגם לאחור כל רצף חומצות אמינו לרצף חומצות גרעין מהונדס. השתמשו בטבלת שימוש בקודונים המתאימה כדי לבצע אופטימיזציה של הרצף עבור ביטוי בקו תאים ספציפי.

במקרה זה, חיידשיי e coli. ברגע שרצף הגן המטרה מוכן, בצעו שיבוט ומיקום וירטואליים של הגן לתוך פלסמיד וקטור מתאים לביטוי חיידקי. במקרה זה, וקטור PET 28 משופר.

וקטור זה מכיל רכיבים מסוימים הדרושים לביטוי ולניקוי חלבונים. הגן המטרה מובנה כך שיכלול רצף של תג היסטידין בקצה N או בקצה C של החלבון, ורצף חיתוך המאפשר את הסרת התג במהלך הניקוי. בנוסף, הווקטור כולל גן לעמידות לאנטיביוטיקה לצורך בדיקת ביטוי ותסיסה.

כל רצף גנטי של חלבון מטרה נוצר בשיטות סינתזת גנים סטנדרטיות כהכנה לשיטת pipe cloning (שיכפול ראשוני חלקי של פולימראז), שהיא אסטרטגיית שיכפול מבוססת PCR שבה הגן המטרה מוגבר באמצעות פריימרים המשלימים לווקטור המיועד. שיטה זו מנצלת את אופיו החלקי של שלב ה-PCR המאוחר, המותיר את תוצרי ה-PCR עם קצוות בעלי גדיל יחיד משתנים. אני מכין את ה-insert PCR או IPCR על ידי הוספת חמישה µL מכל אחד מהפריימרים הקדמי והאחורי לכל תגובה.

בפלטה בעלת 96 בארות, בהתאם למפת הפלטה, הוסיפו שתי מיקרוליטרים של כל גן סינתטי באורכו המלא לבאר המתאימה לפי מפת הפלטה. לאחר הוספה של 25 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר PFU לכל אחת, הריצו את התגובות ב-25 מחזורים תחת תנאי PCR הבאים. דנטורציה ב-95 degrees Celsius למשך 30 שניות.

חימום ב-50 °C למשך 45 שניות והארכה ב-68 °C למשך שלוש דקות. הגברת המקטע מאושרת על ידי אנליזת ג'ל AGROS של תוצרי ה-IPCR. תוצרי IPCR מוצלחים מיוצגים על ידי פסים ברורים.

תוצאות פחות רצויות נראות לעיתים קרובות כפסים חלשים או כמריחות בתגובה נפרדת. הפלסמיד לביטוי מוגבר באמצעות vector PCR או שזיהוי מקטע VPCR מאושר על ידי אנליזת ג'ל AROS של תוצרי VPCR. לאחר הגברת תוצרי ה-IPCR וה-VPCR, הם מתווספים לפלטת מיזוג (merge plate) ומוכנסים לתרמוסייקלר לצורך תגובת המיזוג.

הקונוסטרוקטים ששוכפלו בהצלחה מותמרים לאחר מכן לתאי e coli בעלי כשירות כימית ומאוחסנים במלאי גליצרול כדי להתחיל את בדיקת הביטוי בשיטת מריחה. כמות קטנה מכל דגימה מתוך מלאי הגליצרול של הקונוסטרוקטים המשוכפלים נמרחת על צלחת אגר נפרדת. הצלחת מוכנה עם מרק תזונה חיידקי והסמן האנטיביוטי Kanamycin המקודד בווקטור, ומודגרת למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C; למחרת.

התחילו תרבית מקדימה עבור כל דגימה על ידי בחירת מושבה בודדת מלוח אגר שגדל לאחרונה. השתמשו במושבה זו כדי להחדיר ל-1.2 milliliters של מצע TB broth בתוספת kanamycin וגלוקוז לצורך עיבוד מקבילי. כל תרבית מקדימה גדלה בבלוק של 96 בארות עם תחתית עגולה.

גודלו למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור ב-220 סל"ד. לאחר הצמיחה למשך הלילה, התחל תרביות השראה בקנה מידה קטן עבור כל דגימה על ידי שימוש ב-40 µL מהתרבית המקדימה להחדרה.

1.2 מיליליטר של מצע TB. תוספת של 50 מיליגרם למילו ליטר של קנמיצין ומערכת novagen overnight express. 1, גדלו את תרביות האינדוקציה ב-20 °C למשך 48 שעות, בניעור של 220 RPM; קצרו את התאים על ידי סרקיזציה ב-4,000 GForce למשך 15 דקות.

שפכו את העילוי ואחסנו את המשקעים בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות לפני עיבוד נוסף לאחר הניקוי. נתחו את החלבון עם ובלי תגובת קיטוע באמצעות אלקטרופורזה קפילרית באמצעות מערכת caliper lab CHIP 90, בהתאם לפרוטוקול היצרן. במקרה של חלבון influenza a PB two, 14 מתוך 34 מבני התת-יחידה הובילו לחלבון מטרה מסיס ועברו לשלב הבא של תסיסה בקנה מידה גדול.

כדי להתחיל תסיסה בהיקף רחב, יש להחדיר למאה מיליליטר של מרק תרבית תאי חיידקים המכיל 50 מיליגרם למילו ליטר של קנמיצין מתוך מאגר גליצרול ולגדל למשך לילה ב-37 °C, בניעור של 220 RPM. למחרת, הרחב את תרבית הקדם באמצעות שימוש ב-10 מיליליטר להחדרה.

ליטר אחד של מצע גידול המכיל מצע השראה עצמית (auto induction media) ו-50 mg/mL של קנמיצין בבקתלה בעלת מחיצות (baffled flask) בנפח של שני ליטרים. נער את התרביות המורחבות בטמפרטורה של 37 °C בערך כל 30 דקות. בדוק את הצפיפות האופטית של התרבית על ידי מדידת בליעה של UV באורך גל של 600 nm.

כאשר תושג צפיפות אופטית של 0.6, שנו את הטמפרטורה של האינקובטור הרועד ל-20 °C לאחר זמן הגדילה הרצוי. הסירו מנתב מייצג של 10 mL מכל סמיכה לבדיקת ביטוי. קצרו את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-5,000 ×g למשך 15 דקות.

שפוך את הנוזל העליון והקפא את משקע התאים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בהליך זה, הפסק את הקפאת עיסת התאים והשעה אותה בבופר ליזיס ביחס של 1 ל-5 לנפח הכולל. ערבב נמרצות במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

השתמשו בשפכטל נקי כדי לשחרר גושי חומר מדפנות הכלי. בצעו ליזיס מכני של התאים על קרח באמצעות מכשיר סוניקטור של בראנד masonic. הבהירו את הליזאט הגולמי על ידי סבוב במערך צנטריפוגה ב-18,000 GForce למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

אספו את הנוזל העליון (supernatant) ושמרו אליקווט קטן לצורך אנליזה לפני המעבר לטיהור בקנה מידה גדול. אששו את ביטוי החלבון בקנה מידה גדול של כל תרבית באמצעות אנליזה של ג'ל SDS page. תוצאת SDS page מייצגת זו מראה ביטוי חלבון חסון, מסיסות של כ-50% ושסועיות (cleavage) של כ-50%.

במקרה זה, תג ההיסטידין הוסר יחד עם תג מסיסות חלבונים נוסף, שתוכנן במבנה המקורי. שרף ניקל משמש להפרדת חלבון המטרה בעל תג ההיסטמין הייחודי מכל שאר החומר התאי, כולל חלבונים בקטריאליים טבעיים. עמודת ניקל אחת מוכנה על ידי שטיפה בארבעה נפחי עמודה של מים מזוקקים להסרת בופר האחסון, ולאחר מכן נפח עמודה אחד של בופר B וחמישה נפחי עמודה של בופר.

ביצוע מקבילי של שיווי משקל בין באפר A לבאפר E מתבצע באמצעות מכשיר הכנת החלבון (protein maker), המסוגל להפעיל מספר עמודות בו-זמנית. טענו כל ליזט מנוקה המכיל חלבון מומס עם תג היסטידין לעמודה נפרדת בקצב של 2 mL לדקה, ולאחר מכן בצעו שטיפות של מספר נפחי עמודה עם באפר A; אספו את התסננת הבאפר ושמרו אותה לצורך אנליזה. אלוטו את החלבון הקשור בסדרת מדרגות (step gradients) עם באפר A ובאפר B ביחסים של 95% ל-5%, 60% ל-40%, ולבסוף 100% באפר B. הרכיבים בבאפר B מתחרים עם ההיסטידין על שרף הניקל ובכך מסירים את החלבון מהעמודה ביחס נתון.

אספו כל פרקציית אלוציה בנפרד. כאן מוצגת תוצאה מייצגת של כרומטוגרמה מהרצה בעמודה מסוג nickel one. נתחו באמצעות SDS page את הפרקציית שהסרו מה-nickel one, את הליסאט הגולמי, את הליסאט המזוקק ואת ה-flow through של ה-nickel one, והשוו זאת לספיגת ה-UV ב-280 nanometers שנמדדה במהלך טיהור העמודה.

שלב זה קובע אם הטיהור הצליח. יש לבחור ולאחד את הפרקציות המכילות את חלבון המטרה כדי להמשיך לעיבוד נוסף. חשב את הכמות הכוללת של החלבון בשלב זה באמצעות מקדם האטילה התאורטי של החלבון, על ידי מדידת בליעת UV ב-280 nanometers והתחשבות בנפח הכולל של הפרקציות המאוחדות.

שמרו דגימה קטנה לצורך אנליזה. הגן עבור חלבון המטרה קודד עם רצף ספציפי, אשר מזוהה על ידי ULP one כאתר חיתוך, ולכן הוספה של ULP one תביא לחיתוך בין תג ההיסטידין לבין חלבון העניין. כדי להתחיל בהליך זה, הוסיפו מיקרוליטר אחד של ubiquitin like protease, one, עבור כל 5 mg של חלבון הנמצאים בפרקציות המאוחדות.

בשלב זה, החלבון המנוקא מועבר מתוסף B לתוסף A להמשך עיבוד באמצעות שקי dialysis; יש לבצע דיאליזה לחלבון כנגד שני ליטרים של תוסף A למשך ארבע שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב. השתמש ב-10 kilodalton molecular weight cutoff עבור PB two לאחר הדיאליזה. הרץ ג'ל SDS-PAGE נוסף של חלבון המטרה עם ובלי נוכחות של ULP one.

שלב זה יקבע אם שיוט ה-ULP one הצליח ויאפשר בחירה של הפראקציות הטובות ביותר להמשך עיבוד. מוצגים כאן תוצאות SDS page מייצגות עבור שלושה קונסטרוקטים של הפולימרז pb. שני סממני משקל מולקולרי של תת-יחידות נמצאים בנתיב one.

נתיבים שניים, שישה ו-10 הם חלבונים מאוחדים מעמודי ניקל 1. נתיבים שלושה, שבעה ו-11 מכילים את השברים של החלבון המנוקה בבופר A מניקל 2, ונתיבים ארבעה, שמונה ו-12 מראים את הסרת תג ההיסטמידין בבופר B מניקל 2.

לאחר הסרת ההיסטמין, מרכזים את הפראקציות המאוחדות מעמודת הניקל השנייה. כדי להתחיל ב-SEC, יש לבחור שוב את השרף המתאים בהתבסס על המשקל המולקולרי של חלבון המטרה. במקרה זה, נעשה שימוש בעמודת acere S 110 over 30 GL, אשר שווויה עם 200 milliliters של SEC buffer בקצב זרימה של 0.5 milliliters לדקה. באמצעות מזרק של five milliliters, טוענים את הדגימה לתוך sample loop של 10 milliliters ומתחילים בהרצת עמודת ה-SEC. יש לעקוב אחר הכרומטוגרם של בליעת ה-UV ב-280 nanometers תוךما איסוף פראקציות בנפחים קטנים.

העבירו את כל מקטעי ה-SEC הרלוונטיים ב-SDS page. הגישה הסטנדרטית לניסיונות גבישization של חלבון מבוצעת בשיטת הטיפה הישובה (sitting drop) הכוללת דיפוזיה של אדים. נהוג להקים שניים או יותר של מסכי מטריצה דלילה (sparse matrix screens) כבר בשלב ההתחלתי עבור כל חלבון מטרה.

כדי להתחיל תהליך זה, מלאו מראש כל מאגר של פלטת התגבשות קומפקטית זוטרה בעלת 96 בארות ב-80 µL מכל תנאי במסך ההגבשה הנבחר; העבירו 0.4 µL של חלבון בבופר SEC לכל אחת מ-96 הבארות. לאחר מכן, הוסיפו 0.4 µL ממסך ההגבשה, תוך הבטחה לערבוב מלא של הטיפה בכל בארה. כסו את הפלטה כולה בסרט איטום שקוף למבדיד, תוך הבטחת איטום מלא של כל בארה; אחסנו את הפלטה בטמפרטורה של 16 °C במקום שקט ללא רעידות סביבתיות.

יש לבדוק את התגבשות החלבון באופן תקופתי במהלך השבועות הקרובים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. אם לא הופיעו גבישי חלבון, יש להכין פלטות חדשות עם תנאים שונים ולשנות את ריכוז החלבון בטיפה הסופית כדי להגדיל את הסיכוי להצלחה לפני הקציר. יש לקרר puck מסוג A LS בתוך כלי מלא בחנקן נוזלי ולכסות במכסה כדי להתחיל בקציר.

גזרו את הסרט השקוף המכסה את הבאר שבה נמצא קריסטל החלבון המטרה לבאר ריקה סמוכה. הוסיפו 1.6 µL של תנאי ההתגבשות המתאים ושמרו אותו יחד עם 0.4 µL של ethylene glycol. תמיסה של 20% ethylene glycol בתנאי ההתגבשות מגינה על קריסטל החלבון.

במהלך ההקפאה הקריוגנית, יש לנתח את הגביש תחת המיקרוסקופ ולבחור לולאת קריו (cryo loop) מתאימה לאיסוף, כך שקוטרה הפנימי של הלולאה יתאים לרוחבו המקסימלי של הגביש. חברו את לולאת הקריו למוט מגנטי לגבישים ודלפו את הגביש ישירות מתוך תמיסת הבאר. טבלו מיד את לולאת הקריו עם הגביש שנאסף לתוך חומר קריו-פרוטקטור (cryoprotectant) ולאחר מכן טבלו אותה בתוך puck מסוג LS.

לקירור מהיר (flash freeze), הקפיאו את חזרת הגביש עבור מספר הגבישים הרצוי. לאחר השלמת האיסוף, השתמשו במוט דחיפה (puck wand) כדי להניח מכסה מגנטי על הדיסקה המכילה את הגבישים שהוקפאו במהירות עם לשוניות כפופות. הפכו את הדיסקה עבור השלב הבא.

הברגו דוחף דיסקיות (puck pusher) על הדיסקית, לאחר מכן העבירו את הדיסקית ל-KU actor doer והשתמשו בו כדי להסיר את המכסה. הגבישים שבדיסקית נותרים קפואים באמבט חנקן נוזלי עד שהם מוכנים למחקרי עקיפת קרני רנטגן באמצעות תוכנת רכישת התמונות J Director. הגדירו את הפרמטרים הבאים לסריקת גבישים: חריץ קרן ב-0.5 degrees, מרחק גלאי של 50 millimeters, שלב תמונה של 70 degrees וזמן חשיפה של 30 seconds.

להלן צילום מסך לדוגמה מתוכנת רכישת התמונות בזמן סריקת גביש; הפאנל המרכזי מציג עקיפת קרני X שנצפתה מגביש מייצג, אשר נאספו עבורו מספיק תמונות ברזולוציה גבוהה עבור סט נתונים מלא הדרוש לקביעת מבנה תלת-ממדי. אסטרטגיות השבט והטיהור של החלבון שהודגמו בסרטון זה הניבו 14 דגימות מטהרות של PB two, שתוכנן תשע הניבו גבישים המתאימים למחקרי עקיפה. סט נתוני עקיפת קרני X פנימי נאסף עבור חמישה מתוך תשעת המבנים באמצעות קרינת QK alpha, תוך שימוש במחולל קרני X עם אנודה מסתובבת מסוג rigaku super bright FRE plus, המצויד ב-ossec variax hf, אופטיקת HF וגלאי Saturn 944 plus CCD.

כאן מוצגת תמונת עקיפת קרני רנטגן (X-ray diffraction) של תת-היחידה PB two של הפולימרז. כל מערך נתונים עובד, ובסך הכל נקבעו ארבעה מבנים של תת-היחידה PB two. כל מבנה עבר ביקורת עמיתים והועלה למאגר הנתונים של החלבונים (protein data bank) לגישה ציבורית.

איור זה מציג דיאגרמות סרט של המולקולות ביחידה האסימטרית הקריסטלוגרפית. משני המבנים של PB two, המבנים השניים צבועים בדפוס גביש (rainbow) עם קודי PDB המתאימים. בטבלה זו מוצג ניתוח התוצאות עבור יעדי ה-PB two של השפעת על פי השיטות המתוארות במאמר וידאו זה.

תהליך העיבוד המקבילי רב-המטרות לקביעת מבנה מחלבון על בסיס גן מוצג בחמישה שלבים: שיבוט, ממיסות, טיהור, התגבשות וקביעת מבנה. הפלט של תהליך הביולוגיה המבנית שלנו לא רק מספק את הבסיס למחקר מבוסס-מבנה, אלא גם מזין מחקרים נוספים, כגון בדיקות תפקודיות לאישור תפקוד החלבון או סריקה ביופיזית של תרכובות חדשות באמצעות MAR או SPR, כדי לזהות נקודות פתיחה חדשות לפיתוח תרופות. טכניקה זו והכלים שפותחו לצדה סייעו לסלול את הדרך עבור ביולוגים מבניים לבצע סוגים רבים של חקירות מבוססות-גילוי, כולל עיצוב תרופות מבוסס-מבנה, שהשפיע באופן משמעותי על בריאות האדם והטיפול במחלות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו עיבוד מקבילי של מספר מטרות יכול להגדיל משמעותית את סיכויי ההצלחה של קביעת מבנה. זכרו כי עבודה במעבדה לביולוגיה מבנית עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות מתאימים, כגון שימוש ב-PPE, בעת ביצוע פעילויות מעבדה.