הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

המטרה הכוללת של הניסויים המתוארים היא ניטור אופטי של אינטגרציה של אותות פוטנציאל ממברנה ועיבוד מידע על ידי תא עצב בודד, ברזולוציה של פחות ממיקרומטר ופחות ממילישנייה, ממספר נקודות על הנוירון. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בניית מערך הדמיה בעלת רגישות מתאימה המאפשרת הקלטה של שינויים שבריריים קטנים בעוצמת האור התואמים את הטרנזיאנט של פוטנציאל הממברנה. לאחר מכן, יש לבחור נוירונים בעלי אנטומיה מתאימה להדמיה יעילה – נוירונים עם שלוחות ארוכות ושלמות במישור מוקד אחד קרוב לפני השטח של הפרוסה.

לאחר מכן טענו את הנוירונים שנבחרו מראש בצבעים רגישים למתח כדי לאפשר מעקב אופטי אחר שינויים בפוטנציאל הממברנה. התוצאות מראות את היכולת הייחודית של גישה זו להשגת מידע על אינטגרציה של אותות חשמליים על ידי תאי עצב בודדים, באמצעות ניטור אותות פוטנציאל ממברנה מאקסונים, דנדריטים וקוצים דנדריטיים. בנורופיזיולוגיה תאית.

כלים חדשים מפותחים בשל שתי מגבלות ארוכות שנים של אלקטרופיזיולוגיה קונבנציונלית: רזולוציה מרחבית נמוכה של מדידות אלקטרודות, וחוסר יכולת להקליט ממבנים קטנים כגון קולטרלים של אקסונים או קוצים דנדריטיים. כדי להתגבר על חסרונות אלו, ניתן לשלב את גישת אלקטרודת הפאץ' עם טכניקות אופטיות המאפשרות הקלטות מקביליות מכל חלקי הנוירון. כאן אנו מתארים טכניקה כזו, הקלטה אופטית רב-צדדית של תנודות פוטנציאל ממברנה ברזולוציה של קוץ בודד.

בניסוי זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ זקוף ובשלוש מצלמות כדי להתאים את התאורה למצב אחיד. ראשית, הכניסו מסנן צפיפות ניטרלית מתאים למסלול קרן הלייזר. לאחר מכן, מוקדו את העדשה על פני השטח של הפסה הפלואורסצנטית הסטנדרטית.

תוך צפייה בתמונת ה-CCD של שדה הראייה על מסך המוניטור, כווננו את מיקומו של הקצה המקלט של מוליך האור מקוורץ ואת מיקומו של קצה הפלט של מוליך האור באמצעות המפעילים המתאימים בקונדנסור של הפלואורסצנציה האפיגנסטית, וזאת כדי להשיג הארה ממוקדת ואחידה של שדה הראייה. כדי לקבוע את רעש הרעידות, השתמשו בلامידה פלואורסצנטית סטנדרטית עם סימון לא פלואורסצנטי על פני השטח. רשמו את עוצמת האור באמצעות ה-neuro CCD במצב רציף.

מקדו את העדשה על קצה כהה של הסימון השחור והקליטו את עוצמת האור למשך כ-100 מילישניות בקצב דגימה של שני קילוהרץ. לאחר מכן, הציגו את הממוצע המרחבי של עקומות עוצמת האור השברית מכ-20 פיקסלים המקבלים אור מהאזור המואר באופן אחיד ומכ-20 פיקסלים לאורך קצה הסימון השחור. רעש העודף בממוצע המרחבי מהפיקסלים עם קצוות בעלי ניגודיות גבוהה משקף את רעש הרטט במערכת.

חיוני להרכיב את התריס המכני מחוץ לשולחן בידוד הרעידות, כדי שפתיחת התריס לא תכניס רעש רעידות להקלטה האופטית. זהו שלב קריטי. הרכיבו את התריס באמצעות ברגי פלסטיק וחומר בידוד רעידות כדי להפחית את רעש רעידות האקוסטי שעלול נקלט על ידי מערכת ההקלטה האופטית.

כדי לבודד את הרעידות, כווננו את שולחן בידוד הרעידות עד שרעש הרעידות של הפיקסלים המכסים את הקצה החד של התמונה יהיה קטן מרעש הפגיעה (shot noise). חיווט הציוד על השולחן חייב להיות משוחרר כדי למנוע העברת רעידות מכניות למסגרת המיקרוסקופ. בהליך זה, הכינו פרוסות מוח בעובי של 300 עד 400 מיקרון בהתאם לנהלים סטנדרטיים, תוך שימוש בקו עכברים המבטא EGFP בתאי עצב בודדים רלוונטיים, באמצעות מערכת קונפוקלית של דיסק מסתובב (spinning disc).

בצעו ויזואליזציה של הנוירונים המסומנים ב-EGFP בפרוסה. לאחר מכן, בחרו נוירונים עם עצי דנדריטים ואקסונים שלמים, שזרועותיהם רצות במקביל ובקרבה לפני השטח של הפרוסה, לצורך דימות פוטנציאל ממברנה. לאחר מכן, מלאו פיפטת patch מזכוכית מהקצה תמיסה תו-תאית ללא צבע, עד לשני שלישים מההסתייפות של האלקטרודה, על ידי הפעלת לחץ שלילי למשך כ-15 שניות.

לאחר מכן, מלאו שוב את האלקטרודה בתמיסה המכילה את צבע המתח הרגיש לממברנה IMP permeate המומס בתמיסה התוך-תאית. כעת, בצעו פאץ' (patch) לנוירון שנבחר מראש תוך דקה מהטענת הצבע אל האלקטרודה. הפילו לחץ חיובי נמוך של כ-10 millimeters of mercury לפני הורדת הפיפטה לאמבטיה; פעולה זו, בזמן מיקום האלקטרודה בתוך הפרוסה, מבטיחה ששום צבע לא ידלף מהאלקטרודה לפני יצירת האיטום.

העלה ללחץ גבוה של כ-100 מילימטרים של כספית רגע לפני שהאלקטרודה תיגע במשטח התא. לאחר יצירת האטימה בתצורת תא שלם (whole cell configuration), אפשר דיפוזיה חופשית של הצבע מפיפט patch סומטי אל הסומה למשך 20 עד 45 דקות. במהלך דיפוזיית הצבע, נטר את המצב הפיזיולוגי של הנוירון על ידי הקלטת פוטנציאלי פעולה מעוררים במצב current clamp.

בנוסף, נטרו את כמות הצביעה על ידי הקלטת עוצמת האור במצב מנוחה מגוף התא (soma) בקצב דגימה של שני קילוהרץ ובשבריר מעוצמת האור המקסימלית, כפי שכוון באמצעות מסנני צפיפות ניטרלית. המשיכו בתהליך ההורדה עד שפוטנציאל הפעולה מתחיל להתרחב. בסיום הצביעה, משכו בזהירות את פיפט הפאץ' מהסומה בתצורת voltage clamp כדי להבטיח שהמעבר מתצורת תא שלם (whole cell) לתצורת outside-out patch יושג במהלך התהליך.

לאחר מכן, הדגרירו את הפרוסה למשך 1.5 עד שעתיים נוספות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לצבע הרגיש למתח להתפשט אל תוך הבליטות העצביות. לאחר שכמות משמעותית של צבע דיפוזה מהסומה אל תוך הבליטות הדנדריטיות והאקסונליות, צורת הגל של פוטנציאל הפעולה אמורה להיות משוחזרת לחלוטין. בשלב הבא, אתרו את הסומה של הנוירון הצבוע תחת פלואורסצנציה בעוצמה נמוכה.

הפחיתו את עוצמת האור באמצעות מסנני צפיפות ניטרלית (neutral density filters) למינימום הנדרש כדי להדמות את האובייקט המבוקש באמצעות במה מסוג XY. סרקו את אזור הפרוסה המכיל את הנוירון הפלואורסצנטי עד לזיהוי הסומה הפלואורסצנטית. מקמו את הסומה של התא הצבוע במרכז שדה הראייה של המיקרוסקופ ובצעו patch לנוירון באמצעות אלקטרודת patch סטנדרטית ללא צבע תחת DIC. לאחר מכן, הדמיעו את השלוחות הנוירונליות תחת פלואורסצנציה בעוצמה נמוכה בקצב פריימים של 10 עד 40 hertz במצב הקלטה רציף של ה-CCD לצורך דימוי מתח (voltage imaging).

השתמש במערכת מיקום XY כדי למקם את תבלת העצב הרלוונטית במרכז אזור הדימוי. בנוסף, הגן על ה-SOMA מפני אור העירור באמצעות דיאפרגמה (field stop iris) סגורה חלקית של המיקרוסקופ כדי להפחית את הנזק הפוטודינמי. לאחר מכן, רשום את האותות האופטיים הקשורים לפוטנציאלי פעולה הנעים לאחור בענפי הדנדריטים הבודדים.

לאחר מכן, רשום את האותים האופטיים הקשורים לפוטנציאלי פעולה באקסון. לאחר מכן, רשום את האותים האופטיים הקשורים לפוטנציאלי פעולה הנעים לאחור בקוצים הדנדריטיים. השתמש בקצב פריימים מתאים לשחזור מדויק של צורת גל האות.

במקביל, יש לשמור על תקופות ההקלטה ועל החשיפה לאור עירור בעוצמה גבוהה קצרות ככל האפשר, וזאת כדי לצמצם את הדהייה של הצבע (dye bleaching) ונזקים פוטודינמיים. כאן מוצגת ההקלטה של אותות אופטיים. הפאנל העליון מציג תמונת קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של נוירון צבוע עם האקסון שלו במצב ההקלטה.

בעוד שהפאנל האמצעי מציג את תמונת הפלואורסנציה ברזולוציה מרחבית נמוכה של האקסון, שהתקבלה באמצעות CCD המשמש להדמיית פוטנציאל ממברנה, הפאנל התחתון מציג את הקליטות מהאלקטרודה מהסומה ואת הקליטות האופטיות מה-A IS וממסדי רחוב (node of rvi). מוצגים הן הנתונים הגולמיים והן האותים המעובדים. איור זה מציג את אותות פוטנציאל הפעולה מהאקסון של נוירון קורטיקלי L5 שהועמס בצבע הרגיש למתח action.

אותות פוטנציאליים קשורים הוקלטו בקצב דגימה של 10 kilohertz. עקבות אלו מצביעות על פוטנציאל פעולה חולף משלושה מיקומים. ראשון, האלקטרודה המקליטה מהסומה.

שנית, ההקלטות האופטיות מגבשונית האקסון (axon hillock), ושלישית, ההקלטה האופטית מהצומת הראשון של ה-vie, וכאן מוצגים האותים החופפים מאותם שלושה מיקומים. איור זה מציג פרץ של ארבעה אותות של פוטנציאל פעולה בעקיף (back propagating action potential) ממיקומים מרובים בעץ הדנדריטי של נוירון קליפתי מסוג L5, אשר הופעלו על ידי פולסי זרם דפולריזציה קצרים בתדר של 100 hertz. מוצגים כאן אותות של פוטנציאל פעולה מקוץ דנדריטי בודד.

כאן מוצגת השחזור האנטומי שהתקבל מערימה של תמונות קונפוקאליות בשיטת הדיסק המסתובב (spinning disc), וכאן מוצגת תמונת הפלואורסצנציה של אותו אזור שהתקבלה באמצעות מצלמת CCD. עבור הדמיית פוטנציאל ממברנה, עקבי עוצמת הפלואורסצנציה המתאימים לפוטנציאלי פעולה המקרינים לאחור (back propagating action potentials) ממיקומים אחד עד שלו, כפי שסומנו בתמונת ה-CCD, מוצגים בפנל הימני. העקבה התחתונה מצביעה על ההקלטה של האלקטרודה מהסומה.

ההכנה לפני ההקלטה אורכת כשלוש שעות, כולל תקופת ההמתנה לפריסת הקוביות לתהליכים דיסטליים. זמן ההקלטה מוגבל על ידי דעיכה (rundown) רגילה של הדגימה ועל ידי נזק פוטודינמי של PO. מידת הנזק הפוטודינמי פרופורציונלית לעוצמת אור העירור, למשך הזמן ולמספר ניסיונות ההקלטה הבודדים.

בניסויים מסוימים, ניתן לבצע יותר מ-50 הרצות הקלטה לאורך שעה או שעתיים. מדידות אחרות דורשות עירור גבוה, עוצמות אור גבוהות והקלטות ארוכות יותר, ומוגבלות למספר מצומצם של הרצות הקלטה בלבד עקב נזק פוטודינמי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע דימיון מתח (voltage imaging) מכל מבנה האקסון והסיומות של נוירונים בודדים בחתכים של מוח.