תיאור חזותי של Dissection של מערכת כלי הדם המוחית ומשטח קרום המוח הקשורים ודמה עין המקלעת ממוח חולדה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להסיר ביעילות ובמהירות את שכבות הקליפה והעכביש של קשרי המוח ואת מערכת כלי הדם העורקיים הנלווים, המכסים את פני השטח של קליפת המוח הקדמי, המוח האמצעי, התלמוס והקומיסורות, וכן לאסוף את הפלקסוס כורויידס מהחדרים הצדיים. דבר זה מושג תחילה על ידי הסרת בלוטת האצטרובל והפרדת קשרי המוח ומערכות העורקים הצמודות למוח הקדמי. בשלב השני, העורקים והעורקיקים על פני השטח של קליפת המוח מוסרים בזהירות, החל ממעגל ויליס (circle of Willis) הגבתי, ובהמשך אל פני השטח הדורסליים של קליפת המוח, כך ששכבת הקליפה ושאריות קרומי העכביש יישארו מחוברות למערכת כלי הדם, תוך הקפדה על מזעור איסוף רקמות סמוכות מפני השטח של קליפת המוח.

בשלב הבא, הקורטקס והסיבים הקומיסוראליים מופרדים מהמחיצה (septum) ומההיפוקמפוס, ובכך נחשפים הפרוקי הלטרליים כדי לאפשר את השגת הפלקסוס כורואידואידלי (choroid plexus). לבסוף, ההיפוקמפוס מוסר, ובכך נחשפים התלמוס והקאלי (calli) של המוח האמצעי. לאחר מכן מופרדים קרומי המוח (meninges) וכלי הדם הנלווים העלייים לאזור זה.

בסופו של דבר, ניתן לקבוע את השלמות והסגוליות של הקרומים המבודדים והכלי הדם העורקיים הנלווים להם, כמו גם של הפלקסוס הכורואידי, על ידי השוואת פרופילי ביטוי הגנים של כל אחד מהאזורים הללו. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במחקרים הנוגעים למערכת הדם התומכת בתפקוד המוח. היא כוללת דמיון, השוואות והבדלים בתפקוד הפלקסוס הכורואידי בהשוואה לקרומים ולכלי הדם העורקיים הנלווים להם, ביחס לזרימת דם, תפקוד ה-CSF, פגיעות נוירו-טוקסיות וטראומות מוחיות.

כדי להתחיל בפרוטוקול זה, יש להניח מוחות שהוצאו מחולדות מיד לאחר שהורגשו (euthanized) בתוך תמיסת סלין נורמלית קרה מאוד (בקרח) למשך חמש דקות. חשוב לאפשר למוח להתקרר למשך זמן זה לפני הניתוח, כדי שניתן יהיה להפריד את קרומי המוח (meninges) ואת מערכת כלי הדם העורקיים הנלווים (MAV) מפני השטח של הקורטקס. לאחר מכן, הנח את המוח בתחתית של צלחת פטרי מזכוכית המונחת על קרח, עם סנטימטר אחד של סלין נורמלי קר מאוד או תמיסת סודיום פוספאט בבופר (sodium phosphate buffered saline) בריכוז 0.1 molar וב-pH של 7.4.

יש לבצע את כל פעולות הנתיחה כאשר המוח טבול ברובו במי מלח. כדי להתחיל בנתיחה, הניחו את המוח בצד הגבי (dorsal) פונה למעלה בתוך פטריית הפטרי, ואתרו את בלוטת האצטרובל, הנמצאת באזור הוונטרלי (ventral) המדיאלי ביותר בין שתי ההמיספרות. היא ממוקמת ממש באופן רוסטרלי (rostral) למדוללה, ממש מתחת לקשרי המוח (meninges) או על פניהם.

מעל ה-colli. הסירו את בלוטת האצטרובל באמצעות שתי פינצטות קטנות עם קצה כפוף. שימו לב שבלוטת האצטרובל היא בצבע ורוד בדומה לקורטקס, אך לעיתים קרובות היא מוקפת בשאריות של דם וכלי דם שנותרו מהסרת המוח.

בשלב הבא, הפכו את המוח על פניו בתוך פטריית פטרי. לאחר מכן, הפרידו את העורק החוליירי, העורקים הקטנים יותר והקרומים המכסים את הגשר מהקרומים וכלי הדם של המוח הקדמי. לאחר מכן, התחילו בהסרת ה-MAV.

חשוב להתחיל את תהליך הניתוח בצד הגחוני עם העורקים הראשיים של מעגל ויליס (circle of Willis), העורקים המוחים האמצעיים והעורקים הקדמיים. לאחר מכן, החל מאחד ההמיספרים, השתמש בפינצטה קטנה בעלת קצה כפוף כדי לחתוך את העורק המקשר האחורי, מיד מאחור לחיבור של העורק התוך-קרטידי, ובכך להפריד בין העצים העורקיים הקדמיים והאחוריים של המוח הקדמי. לאחר מכן, חזור על אותו התהליך עבור ההמיספר הנגדי.

כעת, תוך כדי תפיסת ה-MCA והעורק הקדמי באמצעות הפינצטה, משכו בעדינות לכיוון גבי-קדמי (anterior dorsal), כך שה-MAV המכסה את קליפת המוח הקדמית-בנטרלית תורם מעל ומסביב למסלול האולפקטורי. פעולה זו מסירה חלק ניכר מה-MAV המכסה את קליפת המוח הקדמית. סובבו את המוח בזווית של 45 עד 90 מעלות ביחס לפטרית, כך שניתן יהיה לשחרר מהקליפה את האזורים הלטרליים-קדמיים יותר של ה-MAV הסובב את אזורי קליפת המוח הלטרליים; תפסו את ה-MCA והעורקים הנלווים ומשכו בעדינות לכיוון הגבי לאורך קליפת המוח.

במידת הצורך, ניתן להשתמש בקצוות הפינצטה כדי להרים ולשחרר את העורקים הראשיים מהקורטקס במהלך הניתוח. כעת, הסירו את האזורים הצדיים האחוריים יותר של ה-MAV. שימו לב כי מומלץ לעבור מהמισפירה אחת לשנייה במהלך תהליך השליפה כדי להבטיח שה-MAV יישאר קר ורווי, כמו כן, עברו בין המיספירות אם נתקלתם בהתנגדות כלשהי בשחרור ה-MAV מהקורטקס.

לבסוף, כדי להסיר את האזורים הדורסליים ביותר של ה-MAV המקיפים את קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית ואת קליפת המוח המוטורית, הפכו את המוח כך שהצד הדורסלי יפנה כלפי מעלה כדי לשחרר חלק זה מהמוח, והשתמשו בקצוות הפינצטה לאורך הסינוס הסגיטלי. חלק זה של ה-MAV שהופק יכול להישמר באופן זמני במי מלח קרים בקרח עד שיהיה דרוש לבדיקה ולניתוח, או להיות מוקפא לעיבוד מאוחר יותר. לעיתים קרובות, ה-MAV המכסה את האזורים האחוריים ביותר של קליפת המוח נשאר מחובר.

הסרתו מוצגת בחלק הבא של סרטון זה. כדי להסיר את הפלקסוס הכורואידי (choroid plexus), ראשית מקבלים את המוח כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה ומחזיקים אותו במקומו בעזרת הפינצטה הגדולה. לאחר מכן, דוחפים את הפינצטה הקטנה כלפי מטה דרך קו האמצע שבין שתי ההמיספרות ומשתמשים בקצוותיה כדי לנקב דרך הקורטקס והקורפוס קלוסום (corpus callosum) אל החלק העליון של קו האמצע של ההיפוקמפוס.

בשלב הבא, השתמש בפינצטה כדי להרחיק את הקורטקס עם הקלוסום מההיפוקמפוס הדורסלי ומהספטום, כך שרוב החדר הצדי (lateral ventricle) יהיה חשוף. ניתן לאתר ולזהות את הפלקסוס כורויידאלי (choroid plexus) לפי הקו האדום הגלי המסמן את העורק הראשי העובר לאורכו. השתמש בשני קצוות הפינצטה כדי להרחיב את הדפנות הצדיות של החדר השלישי ולהגדילו בקצהו הצפוף ביותר.

לאחר מכן, בעזרת פינצטה קטנה, משכו את הקצה הזה של ה-choroid plexus כדי לשחררו. בשלב הבא, השתמשו בפינצטה כדי להרחיב את האזור הקדמי ביותר שבין ה-septum לבין אזור ה-caudate putamen, ושחררו את ה-choroid plexus גם בקצה זה. בצעו את אותו ההליך בהמיספירה הנגדית כדי להשיג את ה-choroid plexus השני שנותר.

שוב, ניתן לשמור רקמה זו באופן זמני בקרח, בקור, בתמיסת סלין, או להקפיאה לעיבוד מאוחר יותר. כדי להסיר את ה-MAV שנותר ומכסה את האזורים האחוריים ביותר של הקורטקס, ראשית, הסירו את ההיפוקמפוס כולו משני ההמיספרים כדי לחשוף את ה-MAV מעל התלמוס והקוליקולי. שימו לב שהסרת חלק זה של ה-MAV תהיה פחות קשה בהרבה מהסרתו מהקורטקס עבור ה-MAV שנותר.

על ידי אחיזה בכלי הדם הגדולים המכסים את החלק הקדמי של התלמוס ומשיכה עדינה של ה-coddly, כלי דם אלה המחוברים לרשת ה-Supra cocurricular מספקים דם להיפוקמפוס הדורסלי ולרשת התלמוס הדורסלי. משיכה עדינה של ה-coddly תביא בסופו של דבר לשחרור רשת ה-supra, ולאחר מכן ניתן יהיה להגיע לחלקים האחרונים של מעגל העורקים ה-coddle. בנקודה זו, יש לנקוט במשנה זהירות כדי להסיר כל שארית של MAV מפני השטח של קליפת המוח הגרנולרית, ה-retros lineal, הראשונית, השמיעתית והחזותית.

כל שארית של MAV קורטיקלי ונטראלי אחורי שנאספה עם חיתוך ה-MAV התלמי ושל הקאלי השנייה צריכה להיות מוסרת ולהתווסף לחיתוך ה-MAV הקורטיקלי הראשון שנותח, במידה ויש לנתח אותם בנפרד. לאחר מכן, כדי להשוות פרופילים של ביטוי גנים בין הסטריאטום, הקורטקס הפריאטלי ואזורי ה-MAV תחת תנאי ביקורת, ניתן לבצע ניתוח ביטוי גנים באמצעות מערכי oligonucleotide של Agilent 0 1 4 8 7 9 גנום חולדה שלם, 4 על ידי 44, 060 mer. פרטים נוספים על העיבוד, הסריקה ואחסון הנתונים הראשוני ניתן למצוא ב-Thomas et al.

כאשר הניתוח מבוצע נכון, רקמות ה-MAV המתקבלות צריכות להיות בשתי ישויות שלמות שמשקלן הכולל הוא כ-35 עד 45 מיליגרם. ה-MAV שהופרד בתחילה ומקיף את רוב הקורטקס צריך לשקול כ-25 מיליגרם, וזה המכסה את התלמוס, הקאלי והקורטקס האוקסיפיטלי צריך לשקול כ-15 מיליגרם.

הרקמה צריכה להיות בעלת גוון ורדרד קל בשל דם שנותר בכלי הדם. הפלקסו חורואידליס (choroid plexus) הדו-צדדי שנסוף צריך להכיל שתי דגימות רקמה שלמות, שמשקל כל אחת מהן הוא 1-2 mg כפי שניתן לראות כאן. כאן אנו רואים השוואה של פרופילי ביטוי גנים בסטריאטום, בקורטקס הפריאטלי וב-MAV תחת תנאי בקרה.

הגרף העליון מראה את הביטוי בסטריאטום בהשוואה לקורטקס הפריאטלי. בעוד שהגרף התחתון מראה את הביטוי ב-MAV בהשוואה לקורטקס הפריאטלי, ניתן לראות שהסטריאטום והקורטקס הפריאטלי קשורים זה לזה באופן הדוק הרבה יותר מאשר ה-MAV. כאן אנו רואים את ביטוי הגנים הדיפרנציאלי ב-MAV בתגובה להיפרתרמיה בהשוואה לבקרה, בתגובה לאמפטמין בהשוואה לבקרה, ובהיפרתרמיה לעומת אמפטמין.

לבסוף, אנו רואים כאן גנים עם ביטוי הגבוה פי 15 ומעלה ב-MAV בהשוואה לקורטקס הפריאטלי ולסטריאטום, המאופיינים לפי תפקוד. רבים מגנים אלו קשורים למערכת הדם ו/או למערכת החיסון. גנים נוספים עם שינויי קיפול גדולים מאוד הם חלבוני המטריקס החוץ-תאי, טרנספורטרים של סוכרים, ומטבוליזם של ליפידים וחומצה רטינואית.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להיות סבלניים במהלך נתיגת ה-MAV. כמו כן, חשוב להקפיד שהמוח יישאר טבול במי מלח איזוטוניים או בתמיסת סבון פוספט (PBS) לאורך כל תהליך הנתיגה. בנוסף, מומלץ לתרגל את חיתוך ה-MAV בארבעה או חמישה חולדות לפני השגת רקמות להפקת נתונים ניסיוניים.