Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

המטרה הכללית של הליך זה היא לצפות בסימביוזה ביו-פלואורסצנטית של חיידקים בתוך הנמטודה המארחת שלהם. דבר זה מושג תחילה על ידי סימון החיידקים בחלבון פלואורסצנטי באמצעות קונז'וגציה. השלב השני הוא בידוד נמטודות AIC על ידי איסוף ביצים.

בשלב הבא, נמטידות ה-AIC גדלות בשילוב עם הסימביונט החיידקי שלהן המסומן פלואורסצנטית, כדי לאפשר התאגשות טבעית ובסופו של דבר לוקליזציה של הסימביונט החיידקי בתוך הנמטידה המארחת. את שכיחות ההתאגשות הזו בקרב אוכלוסיית הנמטידות ניתן לקבוע באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הסימביוזה, כגון היכן ממוקמות החיידקים בתוך המארח שלהם, ומהי התפלגות הנשאות החיידקית בקרב אוכלוסיית מאוחדת?

לאחר גידול בן לילה של זני החיידקים, בצעו תת-תרבית לזני התורם, המקבל והעזר בתוך מצע גידול עשיר בחומרים מזינים ללא אנטיביוטיקה, ביחס של 1 ל-100 של תרבית למצע, ולאחר מכן גדלו את התרביות בטמפרטורה המתאימה לכל זן עד להגעתם לשלב גידול לוגי בינוני. לאחר מכן, שילו את הזנים בתוך פרועת מיקרו-צנטריפוגה אחת וסבבו את התרביות המעורבבות במשך שתי דקות ב-17,900 Gs, שפכו את הנוזל העליון ותלו את המשקע ב-30 µL של מצע טרי. לאחר מכן, הנחתו את התליה על צלחת מצע עשירה בחומרים מזינים ללא אנטיביוטיקה, והמתינו לייבוש הנקודה לאחר שהתליה התייבשה.

דגרו את הפלטה באופן הפוך למשך הלילה בטמפרטורה אופטימלית עבור החיידק המקבל ומותרת עבור התורם והעזר, אם רלוונטי. כעת, גרדו את הנקודה ובצעו מריחה לקבלת מושבות בודדות על פלטה סלקטיבית עם אנטיביוטיקה כדי להשיג תרבית טהורה של חיידקים, ובחרו מושבה בודדת לצורך בידוד.

על ידי סריקה לאיתור פנוטיפים ספציפיים של המקבל. לדוגמה, ניתן להבדיל בין חיידקי cino abdi לבין e coli על ידי ביצוע בדיקת קטלאז; סריקה לאיתור הנוכחות של הפלסמיד תתבצע על ידי אישור פלואורסצנציה תחת אורך הגל המתאים לחלבון הפלסמיד הפלואורסצנטי. לאחר גידול של הסימביונט הבקטריאלי הטבעי למשך לילה, פזרו 600 µL של תרבית החיידקים על 8 עד 10 צלחות אגר ליפיד בקוטר 10 mm, ולאחר מכן דגרו את הצלחות בחושך ללא לחות בטמפרטורה של 25 °C.

לאחר יומיים, הוסיפו 5,000 נמטודות בשלב juvenile זיהומי ב-500 microliters של מצע למשטחי החיידקים. לאחר דגירה של הפלטות בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך שלושה ימים נוספים, הניחו 20 microliters של מים על תבנית מיקרוסקופ. לאחר מכן, השתמשו במקל סטרילי כדי לגרד כמות קטנה של נמטודות ממשטח החיידקים.

הניחו את המקל בתוך המים כדי לאפשר לנמטודות לשחות החוצה. בחנו שקופית זו תחת הגדלה נמוכה. אם ביצים ונקבות נראות לעין, המשיכו כאשר הנקבות מכילות ביצים, שפכו מספר מיליליטרים של מים על פני השטח של הצלחות, סובבו בעדינות את הצלחות ולאחר מכן שפכו את המים למבחנה קונית בנפח 50 מיליליטר.

הנמטודות צריכות להתרחק מהצלחות ולא להיות נראות יותר על פני השטח של הצלחת. יש להמתין עד שהנמטודות ישקעו לתחתית המבחנה, ולאחר מכן לשאוב את עודפי המים מהחלק העליון של המבחנה ולמלא אותה שוב במים נקיים. לאחר המתנה לשקיעת הנמטודות הבוגרות ושאיבה נוספת של עודפי המים, יש למלא את המבחנות הקוניות בתמיסת ביצים.

לאחר מכן, ערבבו את המבחנות באמצעות היפוך עדין במשך 10 דקות בדיוק בטמפרטורת החדר. מיד לאחר הנעורה, סובבו את המבחנות הקוניות בצנטריפוגה למשך 10 דקות בדיוק ב-1,250 Gs ובטמפרטורת החדר, כאשר פונקציית הבלמים (break) מופעלת. לאחר מכן, שפכו במהירות את הנוזל העליון (supernatant), השעיקו מחדש את המשקע באמצעות תמיסת ביצים על ידי פיפטינג, ומלאו את המבחנה הקונית בתמיסת ביצים טרייה.

ערבבו היטב את תמיסת הביצים על ידי היפוך השפופרת שלוש עד חמש פעמים, ולאחר מכן השקיעו מיד את הביצים והשפיכו את הנוזל העליון כפי שהודגם זה עתה. השעיכו מחדש את המשקע ב-misogyny, broth או LB באמצעות פיפוט, ולאחר מכן העבירו את תמיסת הביצים לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. כעת מלאו את השפופרת של 15 מיליליטר ב-lb, שטפו את הביצים שלוש פעמים ב-broth תוך שימוש באותה טכניקה של שלבים מהירים שהודגמה זה עתה, ולאחר מכן דללו את ביצי נמטודת ה-P שהושעו מחדש לריכוז של לפחות 10 ביצים ל-µL.

העבירו את הביצים לצלוחית פטרי בקוטר שישה סנטימטרים המכילה חמישה מיליליטר של LB ואנטיביוטיקה נגד חיידקים קולוניזטורים. ניתן לאחסן את הצלחת עטופה בנייר נצמד למשך עד ארבעה ימים לאחר גידול לילה וברירה של החיידקים הפלואורסצנטיים. השתמשו במקל סטרילי כדי לפרוס 600 microliters של תרבית החיידקים על גבי דיסקיות ליפיד של 10 millimeter, והדגרירו את התרבית בטמפרטורה של 25 degrees Celsius.

לאחר יומיים, העבירו בין 500 ל-5,000 ביצי נמטודות לכל צלחת ליפיד. אם הצלחת אוחסנה, שטפו את הביצים ב-15 milliliters של LB כפי שהודגם זה עתה, לפחות פעם אחת, לפני הזרקת הביצים על מדשאי החיידקים שהוכנו מראש. לאחר מכן, דגרו את תרביות השיתוף של הנמטודות והחיידקים בחושך, ללא לחות, בטמפרטורה של 25 degrees Celsius עד להופעת בני juvenil infective כטבעת לבנה וסבכית בשולי הצלחת.

כאשר נצפו הגלמיים המדבקים (infective juveniles), הסיר את המכסה של צלחת אגר הליפידים והנח את תחתית הצלחת בתוך תחתיתה של פטריה ריקה בגודל 100 מילימטר על 20 מילימטר. לאחר מכן, מלא את הפטריה במים בכמות שתגיע לכמחצית מגובהה של הצלחת הקטנה יותר, והדגר את מלכודת המים עד שצאו הגלמיים המדבקים של הדור הבא אל המים.

לאחר איסוף הנמטודות מהמים או משלב החיים הרצוי ממסביבת גידול בקטריאלית מתאימה, המיסו מספר גרגירים של ole ב-30 µL של מים, והוסיפו 1 עד 2 µL מחומר השיתוק הזה לכל 50 µL של דגימת נמטודות. לאחר מכן, העבירו כ-20 עד 30 µL מדגימת הנמטודות המשותקות לזכוכית כיסוי של מיקרוסקופ והניחו לוחית כיסוי מעל לדגימה. בחנו את הנמטודות באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהן נמצאות בשדה הראייה.

כדי לזהות את מיקום החיידקים, צלם את הנמטודות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה בנוסף להגדרת מיקרוסקופיית אור, ולאחר מכן הֶחפֵל את התמונות. ייתכן שיהיה צורך לנסות מספר הגדלות וזוויות ראייה של הנמטודה כדי לאתר את החיידקים.

אוכלוסיית נמטודות משני מצעים נספרה ודורגה לפי התנחלות של הסימביונט הבקטריאלי. לצורך סטטיסטיקה רהוטה, מומלץ לספור לפחות 100 נמטודות לדגימה, כאשר לפחות 30 מהן נופלות לכל קטגוריה, כפי שמופיע בטבלה. נמטודות אלו מולבשות ברמה של כ-14.6% כאשר הן גדלות על אגר ליפידים ו-68.6% כאשר הן גדלות על אגר כבד וכליות.

הוכח כי למינים אחרים של נמטודות וחיידקים יש רמות התנחלות שונות. סכימה זו מדגימה את המראה הכללי של נקבות Steiner NEMA. התמונה המוכנסת מציגה תמונת ניגוד הפרעה דיפרנציאלית (differential interference contrast) של נקבת S fot בהגדלה של 20x.

החץ השחור בתמונה המוגדלת מצביע על הוולבה, בעוד שהחצים הלבנים מצביעים על ביצים גלויות. תמונה זו מראה ביצה מפותחת אך לא בבקעה של נמטודה מסוג volt בהגדלה של 40x, וביצים אלו, שבודדו מנמטודות s Volta, צולמו תחת הגדלה של 10x. כאן, בתמונה הראשונה, מוצגות תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של נמטודות Steiner Nima הקשורות לחיידקי Xeno aptus.

הנמטודות של אלבין הוצמדו לסמביונט החיידקי שלהן המבטא GFP כדי ליצור תמונה מורכבת זו. תמונת ניגודיות פאזה הונחה מעל תמונה פלואורסצנטית. החץ מצביע על החיידקים הנוכחים בתוך נמטודה בשלב juvenile זיהומי.

תמונה זו מציגה נמטודה צעירה מסוג S carpa capsi עם GFP המבטא X nla. התמונה הוכנה באופן דומה לתמונה הקודמת ומציגה את הנמטודה הצעירה כאשר חיידקים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק נראים כמו מוטות ירוקים הממוקמים לאורך כל lumen של מעי הנמטודה. בנוסף להליך המתואר, ניתן לשלב שיטות נוספות כגון מניפולציה גנטית של הסימביונט החיידקי לפני ההתחברות למארח הנמטודה, כדי לענות על שאלות נוספות כגון מהם המנגנונים המולקולריים הדרושים להתחברות בין המארח למיקרובה.