ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לצפות בחלוקת הגנומים הווירוסליים בתאים מתחלקים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי יצירת פלסמיד שניתן להדמיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בשלב זה, פלסמיד מהונדס כך שיכלול חזרות טנדמיות של רצף האופרטור של הלקטוז או LAC O. השלב השני הוא הכנסת הפלסמיד לתאים מתחלקים, ולאחר מכן הדבקת התאים ברטרווירוס המקודד לרספרסור הלקטוז או lac eye המחובר לחלבון פלואורסצנטי.

חלבוני היתוך של מדכא הלקטוז יקשרו באופן ספציפי לרצפי המפעיל של הלקטוז בפלסמיד sub. התאים נצפים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לעקוב אחר פלסמידים בודדים לאורך מספר מחזורי תא. לבסוף, התמונות שנרכשו מעובדות כדי לקבוע כיצד הגנומים הויראליים נשמרים בתאים מתחלקים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון quantitative PCR, Southern blotting או fluorescence in situ hybridization, הוא שהיא מאפשרת מעקב אחר פלסמידים בודדים במספר נקודות זמן. כדי לאפשר ויזואליזציה של הפלסמיד באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה, נעשה שימוש בטכניקות שיクלונינג מולקולרי סטנדרטיות כדי להחדיר לפלסמיד מקטע DNA המכיל כ-250 עותקים של רצף האופרטור של לקטוז, או LAC O. בדוגמה זו, הפלסמיד הוא BAC בגודל של כ-170 kilobase pairs, המכיל את הגנום המלא של נגיף ההרפס הקשור לסרקומה של קאפוסי, או KSHV, ומקודד לעמידות להיגרומיצין.

החדירו את ה-LAC O המכיל DNA פלסמידי לתאי HeLa ו-SLK של יונקים באמצעות טרנספקציה. בכלי תרבית של 60 מילימטר, דגרו את התאים עם 10 micrograms של DNA פלסמידי מנוקה, 25 microliters של lipectomy 2000, 0.5 milliliters של Optum ו-3.5 milliliters של DMEM למשך ארבע שעות. החליפו את המצע ל-DMEM עם 10% fetal bovine serum ואפשרו לתאים להתאושש במשך 48 שעות.

בשלב הבא, פזרו את התאים שעברו טרנספקציה בצפיפות נמוכה בצלחות גדולות, וגדלו אותם במשך שלושה שבועות ב-DMEM עם 10% סרום בקר עוברי ו-300 micrograms per milliliter היגרומיצין כדי לבחור את הפלסמיד שהוכנס; השתמשו בחתיכות של טיפסים סטריליים ובנייר מסנן ספוג כדי להעביר מושבות עמידות להיגרומיצין לצלוחות תרבית חדשות. הניחו את הצלחות באינקובטור; לאחר שבוע עד שבועיים, כאשר השיבוטים שעברו טרנספקציה גדלו עד למילוי הצלחת, בודדו DNA לצורך עיכול רסטריקציה וסאות'רן בלוט (southern blotting) כדי לוודא שהפולימר של פלסמיד ה-LAC O הומוגני ובגודל הצפוי. תמונת הבלוט בדוגמה זו מראה כי פולימר ה-LAC O בשיבטון one הוא הומוגני וזהה לזה של הביקורת החיובית.

בנתיב שבע, אם הפלסמיד לא הונדס כדי לבטא חלבון חילוץ של lactose repressor lac eye, הדביקו קלונים מתאימים עם רטרו-וירוס המקודד ל-lac eye המחובר לחלבון פלואורסצנטי אדום כגון lac eye, TD tomato; TD tomato נבחר במקום חלבונים הפלואורסצנציה שלהם קרובה יותר לירוק כדי למזער פוטוטוקסיות שעלולה להתרחש כתוצאה מחשיפות מרובות לאורך זמן. ברגע שחלבון היתוך ה-LAC eye מוחדר, תרבתו את התאים בנוכחות 200 µg/mL IPTG כדי למנוע מחלבוני היתוך להיקשר ל-DNA. אחד ההיבטים הקריטיים ביותר בהליך זה הוא השגת קלונים בעלי עוצמת פלואורסצנציה מתאימה.

יש לסנן מספר רב של שיבוטים כדי לזהות את אלו בעל פלואורסצנציה אופטימלית. יש לתרבת את התאים למשך שלושה ימים לפחות כדי לאפשר ביטוי של חלבון ה-LAC eye TD tomato. סננו את השיבוטים כדי למצוא את אלו עם רמות אופטימליות של lac eye, TD tomato, המראים אותות ברורים עם רמות מינימליות של רקע של חלבון היתוך שאינו קשור. 24 עד 48 שעות לפני הדימות, פזרו את התאים המבטאים LAC I TD tomato בצלחת עם תחתית זכוכית של 35 מילימטר בצפיפות של פחות מ-10% confluence. הדבר יאפשר לזוגות של תאים להתחלק למושבות של שמונה עד 16 תאים ללא חפיפה. אחת עד שלוש שעות לפני תחילת הדימות.

שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם מצע גידול שאינו מכיל תרופות סלקטיביות ו-IPTG. פעולה זו שוטפת תאים שאינם חיוניים ומאפשרת לחלבוני איחוי של lac eye להיקשר ל-LAC cytes בפלסמידים. החליפו את מצע הגידול בשני מיליליטר של DMEM עם 10% fetal bovine serum ו-25 millimolar Hippies; הדגרירו למשך שעה עד שלוש שעות. רגע לפני הדמיה, החליפו את החלק העליון של כלי התרבית בנייר אלומיניום מתוח בטבעת קיבוע עבור צלחת של 35 millimeter.

כיסוי זה ימנע התאיידות של מצע התרבית, דבר שעלול להעלות את ריכוז המלחים עם הזמן ולהרוג את התאים. מערכת ההדמיה המשמשת בניסוי זה מורכבת ממיקרוסקופ הפוך Zeiss Axio 200 M, המצויד בבמה ממונעת ובמצלמת EM CCD לזיהוי רגיש של אותות. אור עירור פלואורסצנטי מסופק על ידי נורת LED לבנה ניטרלית של מערכת Collibra.

מערכת הדימיון נשלטת על ידי תוכנה לרכישה אוטומטית של תמונות במרווחי זמן ממושכים עם מספר Z stacks. אינקובטור על גבי הבמה משמש לשמירה על התאים בטמפרטורה של 37 °C, וריכוז של 5% עד 10% carbon dioxide בתא לח. השתמש בטבעת חימום עבור העדשה השמנית כדי למנוע מהעדשה לשאוב נוזלים.

חממו את הדגימה כדי לאפשר למערכת זמן מספיק להגיע לטמפרטורה יציבה. כדי למזער ארטיפקטים של תנועה במהלך הניסוי, יש להניח את מערכת הדימוי על שולחן אוויר כדי לבודדה מרעידות. כדי להתחיל את הפרוצדורה לוויזואליזציה של DNA מסומן, השתמשו בדימוי DIC לצפייה בתאים ולקביעת מישור המוקד של החלק העליון והתחתון של התאים במספר שדות ראייה; בכל שדה, עברו למישור מוקד שנמצא במרחק של כשליש מהחלק העליון של התא כלפי מטה, ושמרו את קואורדינטות x, y, Z ברשימת מיקומי הבמה השמורים.

כל אחת מהמיקומים השמורים הללו תהווה את מרכז סדרת תמונות בציר ה-Z כדי ללכוד את התא בתוכנת הבקרת המיקרוסקופ; הגדירו סדרת תמונות בציר ה-Z שתבוצע בכל מיקום שלב שמור, והגדירו מספיק פרוסות כך שכל התא יילכד, יחד עם פרוסות נוספות מעל ומטה למישורי השהות של התאים. בחרו גודל צעד Z של 0.35 עד 0.50 מיקרון כדי לאפשר דגימה מקורבת לפי נייקוויסט (Nyquist) בממד ה-Z. פרוסות אלו מאפשרות זיהוי תנועות תאים במהלך מחזור התא ומשמשות גם בעיבוד לאחר רכישה של ערימות התמונות.

פעולה זו תביא לערימה של 40 עד 60 תמונות, בהתאם לעובי התאים. הגדירו ניסוי של סדרת זמנים (time series) לאיסוף תמונת שדה בהיר (bright field) של ה-Zacks במרווחי זמן של 30 דקות ותמונות פלואורסצנציה במרווחי זמן של 10 עד 60 דקות. אין להשתמש בדימות DIC במהלך הניסוי, כיוון שהוא דורש יותר אור מאשר דימות שדה בהיר סטנדרטי, דבר שעלול לחשוף את התאים לרעילות פוטו-כימית (phototoxicity) מיותרת במהלך ניסויים ממושכים.

הפעילו את הניסוי המבוקר באמצעות התוכנה. ודאו כי המערכת אינה מופרעת בשום דרך במהלך הניסוי. לאחר רכישת כל התמונות עבור הניסוי, בחנו את התמונות עבור כל Zack ונקודת זמן, וגזרו אזורים מיותרים מהתמונות כדי לצמצם את זמן העיבוד של המחשב.

בשלב הבא נשייך מחדש את עוצמת האות לפיקסל המקור בכל ערימת Z. השתמש באלגוריתם דה-קונבולוציה (deconvolution) בתוכנת Axio vision, המבוסס על פונקציית הפיזור הנקודתית (PSF) שנמדדה של מערכת ההדמיה. תוצאת הדה-קונבולוציה מוצגת כאן.

בחנו את התמונות כדי לעקוב אחר שינויי העוצמה ותנועת הפלסמידים במהלך מחזור התא והחלוקה של הפלסמידים לתאי הבת. תמונות אלו, שנוצרו באופן חישובי כדי לכלול מספר מישורי Z שבהם נמצאים האותים השונים, מראות כי הגרעינים של תאי HELOC המבטאים LAC eye TD tomato הם פלואורסצנטיים בשל סימון הלוקליזציה הגרעינית (nuclear localization signal) בחלבון המהומה, הממקם אותו בגרעין. בהיעדרה של I-P-T-G-K-S-H-V, גנומים המקודדים לרצפי LAC O מגייסים עותקים רבים של החלבון הפלואורסצנטי ובולטים כאותים בהירים מעל עוצמת הרקע של הגרעין.

בניגוד לכך, בנוכחות IPTG, חלביונים פלואורסצנטיים מסוג LAC נמנעים מהקישור לרצף הזיהוי lack O שלהם. תמונות של מקסימום אינטנסיביות (Maximum intensity projections) שנרכשו של תא במחזורי תא ב-5 נקודות זמן בניסוי מייצג מוצגות באיור זה. הגנומים הוויראליים המסומנים בפלואורסצנציה בתא הנראה בלוח A מסונתזים כפי שמוצג בלוח B. לאחר מכן, הגנומים הוויראליים מחולקים לתאי הבת במהלך חלוקת התא, כפי שנצפה בלוחות C, D ו-E. מחזור התא של תאי HELOC בריאים נמשך כ-24 שעות, ותאי הבת נצמדים בדרך כלל זה ליד זה וממשיכים להתחלק בו-זמנית במחזור התא הבא.

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לעקוב אחר הגנומים הויראליים בתא לאורך מספר דורות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר מורפולוגיית התאים בזמן הדור כדי להבטיח שהתאים בריאים לאורך כל הניסוי.