Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת
19 בדצמבר 2012
הליך מתואר למניפולציה של פעילות תאי עצב בקליפת מוח פירמידליים מוחיים optogenetically תוך אלקטרו, electromyogram, וריכוז חומצת חלב מוחות המנוטרים. הקלטות ניסיוניות מבוצעות על עכברי כבלים-כבולים בזמן שהם עוברים מחזורי שינה / בעקבות ספונטניים. Optogenetic ציוד מורכב במעבדה שלנו; ציוד הקלטה זמין מסחרי.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למדוד שינה המוגדרת על ידי EEG וריכוז לקטט במהלך גרייה אופטוגנטית בקואורדינטות סטריאוטקסיות מדויקות. יש להשתיל בניתוח את מובילי האלקטרואנצפלוגרפיה והקנולות הדרושות עבור חיישן לקטט וכבל סיב אופטי. לאחר מכן, יש להחדיר את כבל הסיב האופטי ואת חיישן הלקטט המכויל מראש אל תוך קנולות ההנחיה בגולגולת החיה.
בשלב הבא, כווננו את עוצמת גירוי האור הכחול כדי להשיג את התגובה האלקטרופיזיולוגית הרצויה. לאחר מכן, המשיכו באיסוף נתוני האלקטרואנצפלוגרפיה (EEG), האלקטרומיוגרפיה (EMG) וריכוז הלקטט, בעוד לבעל החיים מותר להתנהג באופן ספונטני ו/או לישון. בהשוואה לשיטות אחרות, כגון מחקרים פסיכופרמקולוגיים של ה-EEG, לגישה ניסיונית זו יש את היתרון של ניטור ביוכימיה ואלקטרופיזיולוגיה של המוח בזמן שפעילות הנוירונים מומנפת בזמן אמת ובסולם זמן של פחות משנייה.
לפיכך, הפוטנציאל להשגת תובנות חדשות בתחום חקר השינה הוא גבוה. לדוגמה, ניתן לזהות נלווים מטבוליים ואלקטרופיזיולוגיים של שינה בעלת גלים איטיים. ניתן ליישם סוג זה של ניסוי גם בתחומים אחרים של מדעי המוח, כגון למידה וזיכרון, פלסטיות סינפטית או הפרעות אפילפטיות.
הטכניקה הכירורגית מאתגרת מבחינה טכנית. היא דורשת מיומנות רבה, אך ניתן להשיג זאת באמצעות תרגול. בהדגמה חזותית זו, אעבור על השלבים הקריטיים של מספר הליכים כירורגיים מורכבים אשר ישלימו את התיאור הכתוב.
לאחר שהחיה התאוששה מהניתוח, האתגר הוא להחדיר כראוי את חיישן הלקטאט ואת כבל הסיב האופטי. ג'ונתן ואני נדגים כיצד להשתמש באחיזה יציבה בזמן ריסון החיה כדי להחדיר את שני רכיבי הציוד העדינים הללו. לבסוף, נראה כיצד למקסם את תגובת ה-EEG על ידי התאמת עוצמת הגירוי בזמן אמת.
עבור ניסוי זה, השתמש בעכברים טרנסגניים המבטאים את תעלת הקטיונים הרגישה לאור כחול. התעלה מובנית בנוירונים של קליפת המוח. ראשית, הרدم את העכבר באמצעות 5% isof fluorine ו-95% oxygen לצורך ההשראה, תוך שמירה על ההרדמה באמצעות 3% isof fluorine ו-97% oxygen.
בצעו חתך מדיאלי בחלקו העליון של הגולגולת, מהמרווח שבין העיניים ועד לחלק האחורי של הגולגולת. נקו את הגולגולת באמצעות מי חמצן ותמיסת סליין סטרילית. אתרו וסמנו את נקודות B ו-Lambda לצורך קביעת קואורדינטות סטריאוטקסיות עבור תצורות של גירוי אופטוגנטי באלקטרודות. קדחו חורי הברגה ראשוניים באמצעות מקדחה דנטלית במהירות גבוהה עם מקדח כדורי בקוטר 0.5 millimeter, ולאחריו מקדח כדורי בקוטר 0.7 millimeter.
הבריגו את ברגי הקלו-גרם של האלקטרודה אל תוך החורים באמצעות מברג שטוח. סובבו אותם כארבעה עד חמישה סיבובים כדי להגיע לעומק הרצוי. החזיקו את קנולות המדריך במקומן באמצעות קנולה סטריאוטקטית, ולאחר מכן הצמידו אותן לגולגולת ולעוגנים באמצעות צמנט אקרילי. כדי לשמור על פתיחות התעלה, כל קנולה מדריכה צריכה להכיל קנולה דמי (dummy cannula) או סטילט מרגע הניתוח ועד למועד הניסוי.
לאחר מיקום ה-EEGs והקניולות המנחות בגולגולת, הצמידו אותם יחד באמצעות שכבה דקה של דבק אקרילי דנטלי. לאחר התקשות הדבק, מקמו את המחבר הפלסטי מעל תלולית הדבק היבשה, והלחימו את קצות החוטים היוצאים ממוצאי ה-EEG למגעים שבמחבר הפלסטי, למקרה שחוטי המוצא ייקבעו בתוך הדבק. לאחר מכן, השחילו את חוטי האלקטרומיוגרמה אל תוך השרירים על ידי החלקתם לתוך גוף של מחט בכיול 21 gauge.
לאחר החדירה דרך השריר, קשרו קשר כירורגי כפול באמצעות תפר ניילון 5-0 סביב חוטים אלה, ממש דיסטלית לנקודת יציאתם מהשריר. תפרו חזרה את העור שהורחקה כדי לגשת לרקמת השריר באמצעות קשרי כירורגים בודדים וקטועים, תוך שימוש במחט P-3 בעלת חיתוך הפוך ובתפר ניילון 5-0. לאחר תכנות יחידת הגירוי של ה-mc, הפעילו אותה כגנרטור אותות עצמאי כסיגנל בינארי של הפעלה-כיבוי (on-off) ב-5 volt. חברו את יחידת הגירוי של ה-mc ליחידת הכוח של הלייזר התומכת ב-TTL באמצעות מחברי BNC.
חבר את יחידת הספק של הלייזר ללייזר באמצעות כבל סרט. כמו כן, חבר את הלייזר למחבר FC הזכר של כבל הסיב האופטי המקורי. חבר את כבל הסיב האופטי המקורי למחבר הסיבובי.
מחלף (Commutator) של מפרק סיב אופטי מסתובב משמש כמחלף. כאשר בעל החיים נע בתוך הכלוב, המפרק המסתובב מסתובב כדי למנוע שבירה של כבלי הסיב האופטי כתוצאה ממומנט סיבוב. בעזרת אזיקי פלסטיק, הצמיד את המחלף למעמד מתכת הממוקם מעל הכלוב הגלילי שבו שוכן בעל החיים.
רסנו את העכבר באמצעות יד אחת המקבעת את העכבר תחת כף יד מקופלת. כוונות את הראש בין האצבע המורה לאצבע האמצעית של הנסיין. כעת, נקו את הקנולה המנחה משאריות באמצעות מחט סטרילית בכיול 25 gauge.
לאחר מכן, הכניסו את כבל הסיב האופטי באופן ידני וחבקו אותו לקנולת המדריך של הסיב האופטי באמצעות פקק הברגה. בקר את עומק ההחדרה של כבל הסיב האופטי לתוך המוח באמצעות קשר תפר שנקשר על כבל הסיב האופטי במרחק קבוע מהקצה החתוך והשטוח. החיישן עובר כיול בתוך phosphate buffered saline ונחשף לשלושה ריכוזים של L lactate באופן מדורג.
בהתאם לפרוטוקולי היצרן, הכניסו את החיישן שעבר כיול מראש אל תוך הקנולה המנחה ללקטט המותקנת בגולגולת, באופן זהה להליך ההחדרה של כבל הסיב האופטי. חברו את חיישן הלקטט למגבר המקדימה של ה-pinnacle 8, 400 biosensor באמצעות מחברי תקע ביפולריים. לאחר מכן, חברו מגבר מקדימה זה למחבר בעל שמונה הפינים שמושתל בניתוח על הראש.
לפני איסוף הנתונים, השתמש בכפתור בקרת עוצמת הלייזר כדי לכוונן את עוצמת הגירוי האופטוגנטי. אמפליטודת תגובת ה-EEG תשתנה בין בעלי החיים עקב גורמים שלא נחקרו באופן שיטתי. לכן, יש לכוונן את עוצמת הגירוי האופטוגנטי ולוודא שתגובת ה-EEG הולמת כאשר הושגה התגובה הרצויה.
אסוף נתונים באמצעות מערכת Pinnacle 8, 400 עם מדד נוירולוגי (neuro score). ממשק SEIA מסווג את מצבי השינה באמצעות בדיקה חזותית של תהליך נתוני ה-EEG וה-EMG. הנתונים מחולקים למקטעים (epochs) של עשר שניות כערנות, שינה ללא תנועות עיניים מהירות (non rapid eye movement sleep), או שינת REM (rapid eye movement sleep) בהתבסס על ה-EEG וה-EMG.
תצורת גירוי אופטוגנטי זו של חיישן ביולוגי מציגה את אלקטרודות ה-EEG שהושתלו בניתוח, חיישן לקטט וקנולה לגירוי אופטוגנטי. בהיעדר גירוי אופטוגנטי, עכבר זה עבר שינה ספונטנית. מעברים למצב ערות התרחשו בעוד ש-E-E-G-E-M-G וריכוז לקטט מוחי נוטרו באופן רציף בשעת ערות ובשני סוגי השינה.
תנועת עיניים מהירה (REM) ותנועת עיניים שאינה מהירה (non-REM) מוגדרות על בסיס ה-EEG וה-EMG. באופן מעניין, הזרם בחיישן הביולוגי של הלקטט עולה כפונקציה של EEG באמפליטודה נמוכה, ויורד כפונקציה של EEG באמפליטודה גבוהה. שני הערוצים של ה-EEG מגיבים לגירויים אופטוגנטיים המועברים לקורטקס הפרונטלי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבצעים השתלה כירורגית בעכבר לצורך מניפולציה אופטוגנטית סימולטנית ומדידה של האלקטרואנצפלוגרם, האלקטרומיוגרם וריכוז הלקטט במוח. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה כירורגית זו כראוי בתוך 90 עד 120 דקות. זכרו לנטר באופן רציף את נשימת בעל החיים כמדד לעומק ההרדמה.
אם בעל החיים נושם בתדירות נמוכה מפעם אחת בכל ארבעה עד חמישה שניות, ייתכן שההרדמה עמוקה מדי. אם בעל החיים נושם בתדירות גבוהה מפעם אחת בכל שתי שניות, ייתכן שההרדמה קלה מדי. זכרו לנקוט באמצעי הבטיחות המתאימים בעת שימוש בחומר ההרדמה הגזית isof fluorine.
הבטיחו אוורור נאות בחדר הניתוח כדי להגן על הרשתית שלכם מפני הלייזר המשמש לעגיור אופטוגנטי. הרכיבו משקפי מגן או הכניסו את החיה לארונית חסינת אור. מומלץ לתרגל את השתלת החיישן הביולוגי ללקטט ואת כבל הסיב האופטי בעכבר ער לחלוטין.
עכברים אינם משתפים פעולה עם הליכים אלו ויש לקבע אותם. עם זאת, הקיבוע לא יהיה חזק מדי כדי לא לפגוע בבעל החיים או למנוע נשימה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוצדורה זו מפרטת את המניפולציה של נוירונים פירמידליים בקליפת המוח הצֶבֶרלית באמצעות אופטוגנטיקה, תוך ניטור אלקטרואנצפלוגרם (EEG), אלקטרומיוגרם (EMG) וריכוז לקטט מוחי. מערך הניסוי מבוצע בעכברים המחוברים לכבלים במהלך מחזורי שינה/ערות ספונטניים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אופטוגנטיקה
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- אופטוגנטיקה מאפשרת בקרה מדויקת על פעילות נוירונלית.
- ניטור בזמן אמת של הביוכימיה והאלקטרופיזיולוגיה של המוח הוא קריטי.
- EEG וריכוז לקטט מספקים תובנות לגבי תפקוד נוירונלי.
- שיטה זו מציעה יתרונות על פני מחקרים פרמקולוגיים מסורתיים.
מטרת המחקר
- מדידת שינה המוגדרת על ידי EEG וריכוז לקטט במהלך גירוי אופטוגנטי.
- מניפולציה של פעילות נוירונלית בקואורדינטות סטריאוטקסיות מדויקות.
- איסוף נתונים על פעילות מוחית בזמן שהחיה מתנהגת באופן טבעי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השתיל באופן כירורגי אלקטרודות EEG וקנולות עבור חיישני לקטט.
- הכנס כבל סיב אופטי וחיישן לקטט מכויל מראש אל תוך קנולות המדריך.
- כוונן את עוצמת גירוי האור הכחול לקבלת התגובה האלקטרופיזיולוגית הרצויה.
- אסוף נתוני EEG, EMG וריכוזי לקטט במהלך התנהגות ספונטנית.
תוצאות עיקריות
- הושגה ניטור בזמן אמת של ביוכימיה ואלקטרופיזיולוגיה של המוח.
- מניפולציה מוצלחת של פעילות נוירונלית באמצעות גרייה אופטוגנטית.
- נתונים שנאספו במהלך מחזורי שינה/ערות טבעיים.
- הבנה משופרת של תפקוד נוירונלי ותהליכים מטבוליים.
מסקנות
- שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה לחקר דינמיקה נוירונלית.
- איסוף נתונים בזמן אמת משפר את התובנות לגבי תפקוד המוח.
- סטימולציה אופטוגנטית בשילוב עם ניטור ביוכימי היא יעילה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת קורלציה בזמן אמת בין פעילות נוירונלית למדדים מטבוליים במכרסמים בעלי התנהגות חופשית, ובכך נותנת מענה לפער קריטי בתיקוף מטרות (target validation) שבו יש לקשור פנוטיפים תפקודיים למצבים אנרגטיים. על ידי בידוד הדינמיקה של לקטט כסמן (proxy) לזרימה גליקולית במהלך מניפולציה אופטוגנטית, השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות חשיפת השלכות מטבוליות תלויות-פעילות. גישה זו מגבירה את רמת הביטחון החזויה בשלבים מוקדמים של הגילוי, על ידי אספקת סמנים ביולוגיים כמותיים ובעלי רזולוציה זמנית של מעורבות נוירונלית והשפעה מטבולית במורד הזרם.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות באמצעות קישור בין מניפולציה נוירונלית אופטוגנטית לתנודות של לקטט בזמן אמת, ובכך מבהיר קשרי סיבתיות בין מעורבות המטרה לתפוקה מטבולית.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרה באמצעות קריאות אלקטרופיזיולוגיות וביוכימיות סימולטניות, ובכך מפחית עמימות במנגנון הפעולה.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי מטרות שהמודולציה שלהן יוצרת שינויים אנרגטיים מדידים במעגלים עצביים הרלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקות המשך, על ידי ביסוס פלטפורמה המתאמת בין גרייה נוירונלית לבין תפוקה מטבולית מבוססת לקטט.
- תפוקה כמותית: מספק מדידות של ריכוז לקטט בזמן אמת ובקנה מידה של שניות, המאפשרות ניתוח קינטי וניתוח תגובה למינון של תרכובות נוירומודולטוריות.
- סקילביליות של הסריקה: תומך בהערכה רפרודוקבילית של תרכובות במודלים בעלי התנהגות חופשית, ובכך מגביר את הרלוונטיות התרגומית של סריקות ראשוניות.
מחקר תרגומי ופקליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה מצבי שינה-ערות ושינויים מטבוליים נלווים, ובכך מספק מסגרת לחקר הפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירודגנרטיביות המאופיינות בשיבוש ידוע של ה-EEG והגליקוליזה.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על מדדים עקביים (EEG, lactate) במצבי התנהגות שונים, ובכך תומך בהלימה של סממנים ביולוגיים.
- קידום מותאם סיכון: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי חשיפה השאלה האם מודולציה של המטרה מנרמלת את הצימוד הפתולוגי בין lactate ל-EEG הנצפה במודלים של מחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות ועד לאופטימיזציה של מובילים (lead optimization), ובמיוחד עבור מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) שבהן צימוד מטבולי לפעילות עצבית מהווה גורם מכניסטי מרכזי ליעילות ובטיחות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבחינת היפותזות על ידי מתן אפשרות למניפולציה בזמן אמת של פעילות נוירונלית תוך כדי מדידת שטף גליקוליטי במורד המסלול באמצעות לקטט, ובכך מבהיר את מעורבות המסלול.
- סריקה: משפר את מוכנות הבדיקה באמצעות מדידות לקטט סטנדרטיות וניתנות לשחזור, המשקפות מצבי הפעלה נוירונלית לאורך מחזורי שינה-ערות.
- אנליטיקה: מספק נתוני לקטט ו-EEG כמותיים ובעלי רזולוציית זמן, המאפשרים השוואה סטטיסטית בין תנאים וחישוב של גודל אפקט עבור התערבויות נוירומודולטוריות.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי שימור הלקטט כביומארקר תרגומי של גליקוליזה מוחית, הישים במודלים של מחלות במכרסמים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לבחינת קשרי נוירו-מטבוליים על פני מספר מחלקות מטרה ותחומי מחלה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בין עירור עצבי לבין דרישה מטבולית במעגלים קורטיקליים.
- ערך תפעולי: מספק קריאות לקטט ו-EEG סטנדרטיות וניתנות לשחזור בין נבדקים ומפגשים, ובכך תומך בהשוואה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות בהתבסס על פנוטיפים מטבוליים תפקודיים, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על תיעדוף מותאם סיכון באמצעות זיהוי מטרות המייצרות שינויים הפיכים ותלויי-מינון בדינמיקה של לקטט במהלך גירוי אופטוגנטי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוחים סטריאוטקסיים, אופטוגנטיקה וכיול ביו-סנסורים להשתלה מוצלחת ולרכישת אות יציבה.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל מפרקים סיבובים של סיבים אופטיים, ביו-סנסורים ללקטט ומערכות רכישת EEG/EMG עם סנכרון בזמן אמת.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים כירורגיים, פרמטרי גירוי והגדרות של סף לקטט כדי להבטיח הדירות בין מעבדות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לאזורי מוח, סוגי תאים או מודלים של מחלות שונים, שבהם הצימוד הבסיסי בין לקטט ל-EEG עשוי להשתנות.
- מגבלות מעשיות כוללות פולשנות כירורגית, הגבלות של חיבור פיזי (tethering) על התנהגות טבעית, וסחף של האות הדורש כיול מחודש תקופתי של הביו-סנסור בהתאם להנחיות היצרן.
שאלות נפוצות בביופרמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:18
Anesthesia, Stereotaxic Placement and Clearance of Skull
3:20
Cannulas, EMG Leads and EEG Leads
4:55
Assembly of Rodent Optogenetic Stimulation System
6:42
Measurement of EEG-defined Sleep and Lactate Concentration during Optogenetic Stimulation
8:19
Optogenetic Stimulation: EEG-defined Sleep and Lactate Concentration
9:26
Conclusion
