למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית

מטרת פרוטוקול זה היא לנתח תפקודים מוחיים גבוהים. במודל פשוט, של זחלי DFA, באמצעות תיאבון ולמידה ריחית אסוציאטיבית. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף של 30 זחלים בשלב גוזל שלישי (third instar), המוזנים מבקבוקון מזון.

בשלב הבא, הזחלים עוברים אימון במשך חמש דקות על צלחת פטרי עם פרוקטוז כגמול ומכל ריח בכל צד המכיל octal כגירוי חולפית. לאחר מכן, מבוצע שלב אימון שני של חמש דקות על צלחת ללא גמול הפרוקטוז ועם מכלי ריח בכל צד המכילים Amal acetate. לאחר שלוש חזרות על שני שלבי האימון, הזחלים נחשפים למכלי ריח בצדדים נגדיים למשך מבחן של חמש דקות ללא גמול.

בסופו של דבר, ההעדפה הריחנית היחסית של ריח אחד לעומת Amal acetate מעידה על כך שזחלי דרוזופילה יכולים ליצור אסוציאציה בין גירויים חושמי ריח לבין תגמול של סוכר, וניתן להשתמש בכך כדי לחקור למידה אסוציאטיבית במערכת גמישה גנטית. שיטה זו, בשילוב עם הפרעה גנטית של תפקוד עצבי, יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הלמידה והזיכרון, כגון אילו הם הנוירונים המאותתים על תגמול, או אילו נוירונים נחוצים או מספיקים לרכישה או לשליפה של זיכרון חוזר? הדגמת הפרוצדורה תהיה anti a postop.

דוקטורנט מהמעבדה שלי מכין תחילה צלחות פטרי עם 2.5% aros ללא פרוקטוז. כדי להכין את צלחות הפרוקטוז, יש להוסיף את הפרוקטוז ל-aros המומס ולאחר מכן למזג אותו לתוך הצלחת. לאחר מכן, סמנו כל אחת מהצלחות הללו בסמל שונה כדי להבטיח שהניסוי יבוצע באופן סמיות (blind).

הצלחת המכילה פרוקטוז משמשת כתגמול התניה, והצלחת הרגילה משמשת כלא-תגמול. עבור גירויי ההתניה, הכינו סך הכל שלושה מכלים מותאמים אישית מטפלון עבור ריחות עם 10 µL של one octal טהור. במכסים ישנם חורים קטנים המאפשרים את התאיידות הריח.

שנית, הכינו שלושה מכלים נוספים עם 10 µL של amyl acetate המדולל ביחס של 1:50 בשמן פראפין. דילול זה מושך באותה מידה כפי ש-10 µL של חומר טהור מושכים 30 זבובים הנאספים, ניזונים ולא נודדים, מתוך מבחנת מזון.

ניתן לבצע פרוטוקול זה בכל שעה של היום. הוא אינו תלוי במקצבים צירקדיים. העבירו את הלבאות לצחנת פטרי המכילה מספר טיפות של מי ברז, והזיזו אותן בזהירות קדימה ואחורה באמצעות מברשת.

לאחר מכן, העבירו את הזחלים לצנחית פטרי שנייה המכילה גם היא מספר טיפות של מי ברז. בדקו אם קיימת משחת מזון על דפנות גופן של הזחלים. כעת, הניחו את צנחית הפטרי במערך הניסויי כדי לאמן את הזחלים לקשר בין ריחות לרמז סוכר מסוים.

הניחו מכל ריח בצד שמאל ובצד ימין של אחד משני סוגי הצלחות המשמשים כגירויים. כאן מופיעה אחת שמינית, אך הבחירה היא שרירותית כיוון שהנסיין אינו יודע מהו התגמול. לאחר מכן, הניחו את קבוצת הזחלים במרכז הצלחת.

סגרו את המכסה והמתינו חמש דקות בזמן שהבעליים נחשפים לגירויים. ודאו שהזחלים מסוגלים להתגבר על מתח הפנים של טיפת המים כדי שלא יילכדו ויוכלו לחקור בחופשיות. הניחו מכל חדש של Amal acetate על צלחת פטרי נקייה.

לאחר חמש דקות, השתמשו במברשת לחה כדי להעביר את הזבובים לסוג הכלית ההפוך, שבו נמצאים הגירויים ההפוכים בצדדיו השמאלי והימני. במקרה זה, הריח הוא amal acetate. לאחר העברת הזבובים, סגרו את המכסה ואפשרו לבעלי החיים לחקור את הסביבה במשך חמש דקות.

עם תום זמן זה, הסבב הראשון של האימון הושלם. בצע שני סבבי אימון נוספים באופן דומה לסבב הראשון. העבר את בעלי החיים באמצעות מברשת לחה וחשף אותם לכל שילוב של גירוי וגמול שלוש פעמים בסך הכל.

עבור אתר הבדיקה הניסיונית, הניחו מכלים עם ריח טרי, אחד מכל גירוי, בצדדים נגדיים של צלחת פטרי שאינה מצופה באגרוס. העבירו את בעלי החיים המאומנים למרכז הצלחת. סגרו את המכסה והמתינו חמש דקות.

לאחר חמש דקות, השתמשו בתבנית מתחת לצלחת המגדירה בבירור שלושה אזורים בצלחת — שמאל, ימין ומרכז — וספרו את מספר הלרוות בכל אזור. האזור המרכזי מהווה ציון של חוסר העדפה, מה שהופך את הניתוח למגביל יותר ופחות חשוף להטיה. לבסוף, כדי להשלים את הניסוי, בחרו 30 לרוות חדשות בשלב הזחלים השלישי (third instar) וחוזרו על האימון והבדיקה עם השילוב ההפוך של תגמול וגירויים.

המשיכו להשתמש באותם מכלים עבור הריחות. נדרשים מספר מבחני בקרה כדי לקבוע אם לבעלי החיים הטרנסגניים יש עיבוד ריח תקין עבור גירויי התגמול. הבדיקה להעדפת ריח בבעלי חיים נאיביים (naive) מתחילה באיסוף ושטיפה של 30 זחלים, כפי שבוצע בשלבי האימון והבדיקה.

בשלב הבא, העבירו את הזחלים לצלחת פטרי של אגרו-רוז (agro rose) עם מבחנה אחת של גירויים בצד אחד בלבד. סגרו את המכסה והמתינו חמש דקות. לאחר מכן, בעזרת התבנית, ספרו את מספר הזחלים בצד הקרוב, במרכז ובצד הרחוק של הצלחת ביחס לגירויים.

בצע בדיקה זו עבור כל גירוי ששימש בניסוי כדי לבחון העדפת סוכר נאיבית. הכן צלחות פטרי של "חצי-חצי" על ידי גזירת מחצית מהאגר של צלחת קורד ומילוי החלל הריק באגר מומס מהסוג השני. הקפד ששני החצאים יהיו שווים בנפחם ושלא ייווצר ביניהם קו הפרדה מוגדר.

ייתכן שדבר זה ידרוש תרגול עם צלחת חצי-חצי מוכנה ובטמפרטורת החדר, המכילה 30 זבובים נאיביים שנוקו מהמזון. מקמו את הלרוות בשלב השלישי במרכז הצלחת. סגרו את המכסה והמתינו חמש דקות.

לאחר מכן, באמצעות התבנית, ספרו את מספר ה larvae בכל צד ואת אלו שנמצאים במרכז. הפרוצדורה המתוארת שימשה לאימון ובדיקה של trenchgenic lava. באמצעות גירויי הדוגמה, נאספו הנתונים כמספר ה larvae באזורים שונים של צלחות הפטרי.

לאחר חמש דקות מחוץ להעדפת נתונים זו, חושבו מדדים ונגזרו מדדי ביצוע מהקבוצות שאומנו באופן הדדי. מכיוון שהזחלים שנבדקו היו טרנסגניים, הוצעה להם בחירה בין מכל ריח מלא לבין אוויר, וכן בחירה בין ריחות טהורים לבין ריחות בתוספת סוכר. בחינה של המדדים שחושבו בתרשים קופסא (box plot) גילתה כי בעלי החיים היו מסוגלים ללמוד להבחין בין אוקטנול לבין ML acetate תוך שימוש בריחות פרוקטוז כחיזוק של תיאבון.

הבעליים זיהו את שני הגירויים כמעודדים והפגינו העדפה נאיבית לריח של fructose על פני aero. פרדיגמה ניסיונית זו שימשה בהצלחה עם מגוון רחב של גירויים ריחוניים וחזותיים, וכן עם מגוון רחב של גירויים מתגמלים ומענישים. פרדיגמה זו, בשילוב עם המניפולציות הגנטיות העוצמתיות הרבות הזמינות ב-drosophila, שימושית במיוחד בניתוח רשתות עצביות; לדוגמה, באמצעות מניפולציה גנטית של קבוצות ספציפיות של נוירונים, המוגדרות על ידי תבניות ביטוי של gal four, ניתן להעריך את התפקידים הפונקציונליים של אותם נוירונים בלמידה של תיאבון.

ניתן להשתמש בפרוצדורה זו, יחד עם הפרעה גנטית של התפקוד העצבי, כדי לנתח את הרשתות העצביות במוח הזחל המעורבות בלמידה ובזיכרון. בשל פשטותו של מוח הזחל, ניתן להשיג זאת עד לרמת התא הבודד.