ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת אירועי היתוך תאים המתווכים על ידי snare באמצעות ביטוי מופעל של beta galacto. דבר זה מושג תחילה על ידי ביטוי אקטופי של חלבוני v ו-t snare על פני תאי cost seven. השלב הבא של ההליך הוא שילוב התאים המבטאים חלבוני V snare עם תאים המבטאים חלבוני T snare.

תהליך זה מוביל למיתוך תאים המתווך על ידי snare ולהבעה פעילה של beta galacto. בסופו של דבר, נמדד את פעילות ה-beta galacto שהושרה על ידי מיתוך התאים באמצעות ספקטרופוטומטר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת אזור SAL מיקרוסקופית, הוא היכולת לנתח שילובי snare מרובים.

מבחינה כמותית, אף שניתן להחיל שיטה זו כדי להבין את המנגנון והוויסות של היתוך ממברנות המתווך על ידי snare, ניתן להשתמש בה גם למחקרי תפוקה גבוהה (throughput). את הפרוצדורה ידגימו ד"ר Na Hassan, פוסט-דוקטורנט, ו-David Humphrey, טכנאי מהמעבדה שלי, ביום שלפני טעינת הטרנספקציה.

הכינו פלטות של 24 בארות עם כיסויי זכוכית (cover slips) בקוטר 12 מילימטר; הכינו שתי בארות עבור כל שילוב של תאים המבטאים פלסמידים ייחודיים בניסוי על גבי כיסויים אלו. זרעו 30,000 תאי cost seven שגודלו ב-DMEM עם תוספת של 4.5 grams per liter גלוקוז ו-10% FBS לצורך טרנספקציה. עבור תאי ה-V, הוסיפו לכל בארה רבע מיקרוגרם של פלסמיד TTA וסט אחד של פלסמידים לביטוי.

העבירו את החלבונים הרצויים, ובמקרה זה vamps, כדי לבצע טרנספקציה לתאי T; הוסיפו רבע מיקרוגרם של הפלסמיד המקודד ל-TRE lacks Z, ואת מערכת הפלסמידים המשלימה המקודדת לחלבונים הרצויים. במקרה זה, snap 25, syntaxin one ו-syntaxin four. כעת בצעו טרנספקציה ל-cost seven באמצעות lipectomy בהתאם להוראות היצרן, וגדלו את התאים למשך 24 שעות. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, קבעו את התאים ב-paraformaldehyde מועשר למשך 10 דקות. לאחר הקיבוע, שטפו את התאים שלוש פעמים עם ++PBS, ולאחר מכן חסמו את התאים עם FBS מועשר למשך 30 דקות.

לאחר החסימה, דגרו את התאים עם הנוגדן המוניקלואלי anti-mic Nine E 10 למשך 30 דקות. לאחר ארבעה שטיפות עם PBS++, דגרו את התאים למשך שעה עם נוגדנים משניים המשומשעים ב-FITC בדילול של 1:500. לאחר ארבע שטיפות נוספות עם PBS++, העבירו את התאים המסומנים למסבך באמצעות ריאגנט anti-fade זמין מסחרית.

התאים מוכנים כעת למיקרוסקופיה קונפוקלית. ביום שלפני הטרנספקציה, זרעו 1.2 מיליון תאי costs seven בכל צלח תרבית רקמה של 100 מילימטר, ו-200,000 תאי costs seven בכל באער של פלטות בעלות שישה באערים עבור כל שילוב פלסמידים המיועד לניתוח. הכינו באער אחד, וגדלו את התאים במשך 24 שעות. למחרת, הוסיפו את הפלסמידים לטרנספקציה. עבור תאי V, טרנספקציה של פלסמיד המבטא את חלבון ה-flipped המבוקש ו-5 מיקרוגרם של p tet off לתאים בכל תרבית של 100 מילימטר.

בצע cot transfect לתאי ביקורת בצלחת תרבית של 100 מילימטר עם וקטור ריק ו-P te off באותן ריכוזים יחסיים כמו בתאי ה-V. לאחר שכל הפלסמידים הוספו לתאי ה-V ולתאי הביקורת, הוסף tcom mycin לבארים אלו כדי למנוע N glycosylation של vamps. בכל באר בלוחות שש הבארים, בצע cot transfect לתאי ה-T עם מיקרוגרם אחד של PBIG יחד עם הפלסמידים המשלימים המבטאים את החלבונים הרלוונטיים.

כעת בצעו טרנספקציה לתאי ה-cost seven באמצעות ליפוזומים בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, תרבתו את התאים למשך 24 שעות. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, הפרדו את תאי ה-V מהצלחות התרבית באמצעות בופר לפירוק תאים ללא אנזימים. התחילו בשטיפה חד-פעמית של התאים עם 20 milliliters של PBS.

לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת הפרדה (dissociation buffer) נטולת אנזימים. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, התאים ישתחררו על ידי הקשה חזקה על הפלטה; ודאו תחת המיקרוסקופ שהם התנתקו. אם פחות ממחצית מהתאים התנתקו, המתינו חמש דקות נוספות והקישו שוב על הפלטה.

המשך את הדגירה בבופר ניתוק עד שיותר מחצי מהתאים יסרקו. לאחר מכן, ספור את תאי ה-V באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, השהה את תאי ה-V בריכוז של כ-480,000 תאים למילליליטר בבופר DMEM מועשר.

כעת הוסיפו מיליליטר אחד של תאי V שהושחאו מחדש לכל באער המכיל את תאי ה-T והחזירו את הפלטות לאינקובטור. לאחר שש, 12 או 24 שעות של תרבית משותפת של התאים, שטפו אותם ב-PBS והוסיפו בופר ליזיס. לאחר מכן, גרדו את התאים מהבבארים והעבירו אותם למבחנות לצורך סבב צנטריפוגה.

לאחר צנטריפוגציה, העבירו את תמיסת העל למבחנה חדשה ומדדו את הביטוי של beta galacto באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן; במהלך פרוטוקול זה, הקפידו לעצור את תגובת ה-cholera metric לאחר 90 דקות על ידי הוספת sodium carbonate בריכוז one molar כדי להעריך את התוצאות. מדדו את הבליעה ב-420 nanometers באמצעות spectrophotometer. כאשר תאי CO seven עברו טרנספקציה עם פלסמידים של flipped snare, חלבוני flipped snare בוטאו על פני השטח של התא.

נעשה שימוש בציטומטריית זרימה כדי למדוד את רמות הביטוי של חלבוני snare על פני השטח של התא. על מנת להשוות את יכולות היתוך הממברנה שלהם, היה צורך לבטא את ה-vamps ברמה זהה. לפיכך, ריכוזו של כל פלסמיד snare הפוך ששימש בטרנספקציה תותמר ואופטימי עבור הטרנספקציה.

תחת תנאים אלו, vamps 1, 3, 4, 5, 7, ו-eight וכן syntaxin one ו-four בוטאו באותה רמה על פני התא בהתאמה; ה-snares הנוירונליים המתווכים אקסוציטוזה סינפטית שימשו לבדיקת היתכנותה של הבדיקה. ואכן, כאשר שולבו תאי V המבטאים vamp two ותאי T המבטאים SYNTAXIN one snap 25, זוהה ביטוי חזק של beta galacto. עם זאת, כאשר vamp two או SNAP 25 לא בוטאו, זוהלה רק פעילות בסיסית של beta galacto sase, דבר המצביע על כך שאיחוי תאים וביטוי של beta galacto sase תלויים באינטראקציות של v-snares ו-t-snares; באופן כללי, ל-SYNTAXIN one, snap 25, vamp one, vamp three, ו-vamp eight הייתה פעילות איחוי דומה והגבוהה ביותר.

לעומת זאת, פעילות הבסיס של beta GAL מרמזת כי שילוב החלבונים אינו מניע היתוך ממברנות, בדומה למקרה שבין vamp five ל-SYNTAXIN one ו-Snap 25. בעת ביצוע בדיקת ההיתוך האנזימטית, חשוב לזכור להוסיף unica mycin כדי למנוע גליקוזילציה של חלבוני esna, ולהוסיף DTT כדי למנוע היווצרות קשרי דיסולפיד בין חלבוני esna.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן ביצוע בדיקת היתוך תאים.