הכנה של קווים סלולריים למציאה מותנית של ביטוי גנים ומדידה של השפעות על מציאת מות תאי E4orf4-induced

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את השפעת knockdown של ACF1 או SNF2H על מוות תאי המושרה על ידי E4 או four. דבר זה מושג על ידי יצירת שורות תאים שבהם ביטוי של srna עבור ACF1 או SNF2H מופעל באופן מותנה על ידי הוספת doxycycline, מה שמוביל לשלב שני של רמות מופחתות של חלבון ACF1 או SNF2H. תאים מהשורות שהתקבלו מטופלים ב-doxycycline להפחתת ביטוי ACF1 או SNF2H, או נשארים ללא טיפול.

בשלב הבא, E4orf4 מבוטא בתאים עם או ללא shRNA העמיד ל-ACF1 או SNF2H. כדי לחקור את השפעתם של ACF1 או SNF2H על מוות תאי המונחה על ידי E4orf4, הושגו תוצאות המראות את השפעת רמות ACF1 או SNF2H על הרעילות של E4orf4, על בסיס ספירה של גרעינים בעלי מורפולוגיה אפופטוטית באמצעות בדיקת JY. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון טרנספקציה זמנית של RNAs, הוא שכל התאים מבטאים את ה-shRNA ואחוז התאים המבטאים אותו יחד עם פלסמיד מסורתי הוא גבוה יותר. שיטה זו מספקת תובנה לגבי המנגנונים העומדים בבסיס מוות תאי המונחה על ידי E4orf4, אך ניתן להחיל אותה גם על חקר של חלבונים פרוטיים אחרים.

בנוסף לאנה לאפה, חוקר מהמעבדה שלי ידגים חלקים מההליך הזה. כדי להתחיל בתהליך ליצירת שורות תאים הניתנות להשראה, זרעו תאי T-Rex 2 9 3 בצפיפות של כ-5×10⁶ תאים לכל צלחת של 10 cm ב-8 mL של DMEM המכיל סרום ללא טטרציקלין ועם 5 µg/mL של Blasticidin. הדגירו את הצלחות למשך לילה ב-37 °C ו-5% CO2. למחרת, החליפו את המדיום ב-8 mL של מדיום טרי לפני הטרנספקציה. הפלסמיד לטרנספקציה הוא הפלסמיד P superior neo plus GFP המקודד עבור ACF1 או SNF2 H-S-H-R-N-A, המונחה על ידי מקדם H1 הניתן להשראה על ידי טטרציקלין, וכן את הגן לעמידות לנאומייסין המחובר ל-GFP ומונחה על ידי מקדם PGK קונסטיטוטיבי.

הוסיפו 10 µg של plasmid DNA ל-500 µL של 150 mM sodium chloride וערבבו במכשיר vortex. לאחר מכן, הוסיפו את reagent jet PY במינון של 2 µL לכל µg של DNA למבחנה אחרת המכילה 500 µL של 150 mM sodium chloride וערבבו במכשיר vortex. הוסיפו את תמיסת jet pie ל-DNA וערבבו היטב באמצעות vortex.

דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, העבירו בזהירות באמצעות פיפט את קומפלקסי ה-DNA לצלחות בקוטר 10 סנטימטר המכילות תאי T-Rex 2 9 3 ברמת התלכדות (confluence) של 70% עד 80%. ערבבו את התאים למחרת.

החליפו את המצע במצע סלקטיבי, במקרה זה DMEM כפי שבוצע קודם לכן, המכיל 500 micrograms per milliliter של G418. במשך השבועיים הבאים, עקבו אחר התאים. החליפו את המצע הסלקטיבי במצע טרי דומה מדי שלושה עד ארבעה ימים עד להופעת מושבות.

זהו את המושבות באופן חזותי וסמנו את מיקומן בתחתית הצלחת באמצעות טוש צבעוני. ודאו תחת המיקרוסקופ שהמושבות מופרדות היטב. ניתן לבודד את המושבות ברגע שהן גדולות מספיק כדי להיראות ללא מיקרוסקופ.

להצלחת הליך זה, חשוב לבחור מושבות מופרדות היטב במהלך בידוד המושבות. בתוך מנדף סטרילי, שאבו את המצע מהצלחת. שטפו בעדינות עם PBS ושאבו היטב את כל הנוזל שנותר.

הוסף שלושה µL של 0.25% tripsin ב-EDTA לקולוניה אחת בצלחת על ידי פיפוט חוזר של ה-tripsin עד שהתאים ניתקים מהצלחת. העבר את התאים למצע סלקטיבי בבאר בתוך פלטת 24 בארות. חזור על פעולה זו עבור מספר קולוניות נוספות בצלחת.

גדלו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide עד שימלאו את הבאר. לאחר מכן, פצלו את התאים מכל מושבה מקורית לשלוש בארות בכל אחת מלוחות 12 בארות נפרדים, והדגירו למשך הלילה למשך היום הבא. החליפו את המצע בלוח אחד במצע המכיל 1 µg/mL doxycycline מתמיסת סטוק שהוכנה במים מזוקקים פעמיים.

החליפו את המצע בצלחת ביקורת במצע ללא doxycycline. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C, ו-5% carbon dioxide למשך 72 שעות. לאחר מכן, קצרו תאים מבאר אחת מטופלת ומבאר אחת לא מטופלת לצורך ניתוח western blot כדי לקבוע את יעילות ה-knock down של ACF one או SNF two H; תוצאה מייצגת מוצגת כאן.

סמיכה זו נצבעה בנוגדנים ל-SNF two H ול-alpha tubulin. האחרון שימש כבקרת טעינה לשני השיבוטים. מספר ארבע ומספר חמש הראו הפחתה חזקה ב-SNF two H עם השראת doxycycline, ולכן נבחרו לשימוש בניסוי ה-knockdown, שיוצג במקטע הבא.

התאים שלא טופלו בצלחת השלישית ישמשו להרחבת שלב התאים הנבחר, ומנות מאותם תאים יוקפאו לאחר מכן. לשימוש נוסף להשראת knockdown של ACF one או SNF two H בתאי צלחות בתווך סלקטיבי בצלחות של 10 centimeter, יש להוסיף doxycycline בריכוז 1 µg/mL למחצית מהצלחות ולדגור ב-37 °C, 5% carbon dioxide למשך 48 עד 72 שעות. כל קבוצת צלחות חייבת לספק תאים עבור 12 צלחות של 6 centimeter, כולל שתי כפילויות עבור בדיקת DPI לכל נקודה, וכן צלחת אחת לניתוח western blot של כל דגימה.

48 עד 72 שעות לאחר ההשראה, נגלה את התאים מכל קבוצת תאים באמצעות טריפסין, ולאחר ספירתם, נזריע 1.5 × 10⁶ תאים לכל צלחת של 6 ס"מ באותו מצע, עם או ללא doxycycline. נדגרי את התאים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך הלילה. למחרת, נבצע טרנספקציה לתאים כפי שצוין.

התאים, הן הבלתי מטופלים והן אלו שטופלו בדוקסיציקלין, עוברים טרנספקציה בשלוש חזרות בארבע דרכים. אחת עם פלסמיד ריק ופלסמיד המבטא GFP; שתיים עם הפלסמיד הריק וכן וקטור המבטא SHRA resistant ACF one GFP או SNF two HGFP; שלוש עם פלסמיד המקודד ל-E four או ארבע; וארבע עם פלסמיד המבטא GFP ועם הפלסמיד המקודד ל-E four, כל הארבע. והוקטור המבטא SHRA resistant ACF one GFP או SNF two HGFP. לאחר הטרנספקציה, דגרו את כל הצלחות המשתיל ב-37 °C וב-5% carbon dioxide למשך לילה.

ביום שלאחר הטרנספקציה של התאים, הוצאת חלבונים מביסית אחת לכל דגימה לצורך ניתוח Western blot כדי לוודא ש-ACF one או SNF two H הושבתו ביעילות וכי E four או four בוטאו באופן שווה בדגימות השונות. 16 הביסית הנותרות ישמשו לבדיקת DPI. שאבו את המצע מהביסית המיועדות לבדיקת DPI ושטפו את התאים בעדינות עם PBS במנדף כימי.

הוסיפו מיליליטר אחד של 4%para formaldehyde שהוכן ב-PBS כדי לכסות את התאים, והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ללא ניעור. שאבו את ה-para formaldehyde ושטפו עם PBS תוך ניעור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. חזרו על השטיפה פעמיים נוספות, לסך הכל שלושה שטיפות; לאחר השטיפה השלישית ב-PBS, העבירו ל-80%Ethanol שנשמר במינוס 20 מעלות צלזיוס והדגירו במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות.

שאבו את האתנול ושטפו את התאים פעמיים עם PBS תוך써ניעור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בכל פעם, ולאחר מכן שטפו פעם אחת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם PBS המכיל 0.5% BSA ו-0.05% Tween 20 או P-B-S-B-T. גם שלב זה יבוצע תוך ניעור כדי למנוע קישור לא ספציפי של נוגדנים. חסמו את התאים במיליליטר אחד של תמיסת P-B-S-B-T המכילה 10% סרום עז למשך 20 דקות תוך ניעור בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים ב-P-B-S-B-T, במשך חמש דקות לכל שטיפה. דגרו את התאים עם הנוגדן הראשוני, במקרה זה נוגדן ספציפי ל-E4 או 4, בנפח של 1 ml של P-B-S-B-T למשך שעה אחת תוך כדי ניעור בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו פעמיים ב-P-B-S-B-T ופעם אחת ב-PBS המכיל 0.1%BSA, במשך חמש דקות לכל שטיפה.

בשלב הבא, הוסיפו לתאים 1 mL של PBS עם 0.1% BSA המכיל את הנוגדן המשני המתאים המסומן פלורוצנטית ו-0.5 µg/mL בריכוז סופי של DPI. הדגרירו למשך 40 דקות תוך כדי ניעור בטמפרטורת החדר ובחושך. לבסוף, שטפו עם PBS למשך חמש דקות.

ייבשו את הבאר באמצעות שאיבה והשאירו את הפלטות הפוכות למשך שעה נוספת ועד ללילה כדי להשיג ייבוש מלא, וכסו בנייר אלומיניום; התקינו זכוכית כיסוי על התאים באמצעות תמיסת flora Mount G. שמרו את הפלטות בטמפרטורה של 4 °C בחושך עד למועד הספירה. גרעיני תאים אפופטוטיים שעברו את הטיפולים השונים המתוארים בפרוטוקול קובעו ונצבעו עם נוגדנים ספציפיים ל-E4 או עם DPI כדי להנמיש את הגרעינים של תאים שעברו טרנספקציה.

איור זה מציג דוגמה לתאים המבטאים E four or four ו-GFP; פאנל A מציג ביטוי של חלבון GFP לבד כביקורת, ופאנל B מציג ביטוי של E four or four. צביעת DAPI של גרעינים מוצגת בפאנל C והתמונות הממוזגות מוצגות בפאנל D. החיצים הלבנים מסמנים תאים שעברו טרנספקציה של GFP ו-E.Four or four המכילים גרעינים בעלי מורפולוגיה אפופטוטית. חיצים אדומים מסמנים גרעינים בעלי צורות לא סדירות שאינם נספרים כגרעינים אפופטוטים; כוכבית מסמנת גרעינים במיטוזה או גרעינים שזה עתה התחלקו. מספר הגרעינים המעובים או המפוצלים שנצפו באמצעות צביעת DAPI נספר כדי לחשב את אחוז הגרעינים בעלי מורפולוגיה אפופטוטית בתוך אוכלוסיית התאים שעברו טרנספקציה, וזאת על מנת לשמור על אובייקטיביות אופטימלית של הבדיקה.

ספירת גרעינים אפופטוטיים בדגימות השונות בוצעה באופן עיוור, כאשר האדם שביצע את הספירה לא היה מודע לזהות הדגימה. תוצאה מייצגת מוצגת בגרף זה. אחומי גבוהים יותר של anomallies גרעיניים נצפו בתאים המבטאים E4orf4, מה שמאשר כי E4orf4 משרה מוות תאי. האחוז הגבוה ביותר של anomallies גרעיניים נצפו בתאים המבטאים E4orf4 שבהם רמות ACF1 הופחתו באמצעות shRNA-mediated knockdown, דבר המצביע על כך ש-knockdown של ACF1 מגביר את מוות התאים המושרה על ידי E4orf4 ומעצים את הרעילות של E4orf4 בתאים.

ביטוי של רמות נמוכות של ACF לא נבע מעלייה ברמות של E four או four כפי שנראה ב-Western blot. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להקל על ספירה מדויקת של גרעינים אפופטוטיים באמצעות DPI ולהחיל קריטריונים קפדים לזיהוי גרעינים אלו. בנוסף לפרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות קלנוגניות (clonogenic assays), כדי לתקף את תוצאות ה-DA pse בעקבות פרוצדורה זו.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות co-immunoprecipitation, כדי להשיב על שאלות נוספות. למשל, האם קיימת אינטראקציה פיזית בין החלבונים הנחקרים.