Assay רגישות יתר מושהה סוג חוצה vivo להסדרת אנטיגן ספציפי

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש במבחן DTH trans vivo כדי לנטר תגובות ספציפיות לאנטיגן, הן פרו-דלקתיות והן אנטי-דלקתיות, בבני אדם. ראשית, יש לבודד תאים מונונוקלאיים של דם פריפריאלי (PBMC) מדם פריפריאלי של הנבדק. לאחר מכן, יש לערבב את תכשיר ה-PBMC עם PBS.

אנטיגן זיכרון (recall antigen) ואנטיגן בדיקה, ואנטיגן בדיקה בתוספת אנטיגן זיכרון. בצע את מדידות ה-prem בכפות הרגליים והזרק את התערובות שהוכנו לעכברי skid. חזור על המדידות בכפות הרגליים לאחר 24 שעות. שלושה.

דפוסים מובהקים של תגובות DTH יכולים להיות רגולטוריים, לא-רגולטוריים או רגישים (sensitized). ניתן להשתמש במבחן רגישות מאוחרת מסוג trans vivo כדי לקבוע פרמטרים קליניים כגון תגובות allo react, כאשר מקור האנטיגן הוא תאי התורם של השתלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות in vitro קיימות הוא שניתן לזהות בקלות הן תגובות פרו-דלקתיות והן תגובות רגולטוריות לאנטיגנים אלוגנאיים (allo antigens), אנטיגנים אוטוגנאיים (auto antigens) או אנטיגנים של גידולים, באמצעות מערכת מבחן אחת.

אגון, חוקר במעבדה שלי, ידגים כעת את הפרוצדורה תוך שימוש בדם פריפריאלי אנושי טרי שנאסף למבחנות acid citrate dextrose כדי למנוע הפעלת טסיות. בודד PBMC באמצעות lymphocyte separation medium לפי שיטות סטנדרטיות. שטוף את תרחיף ה-PBMC ב-PBS כדי להסיר טסיות מזוהמות.

אם קיימת זיהום ניכר של תאי דם אדומים, בצע ליזיס לתאים האדומים באמצעות CK lysis buffer. לאחר מכן בצע שני שטיפות נוספות עם PBS Resus. השהה את ה-PBMC ב-PBS בריכוז של 10 מיליון PBMC למילליטר עבור ה-allo antigen.

התחילו עם P BMCs, שבודדו מדם היקפי של התורם באמצעות הפרוצדורה שהוצגה קודם לכן. לאחר מכן, השהו את תאי התורם ב-PBS בריכוז של 120 מיליון תאים למילליליטר והוסיפו 1 µM של PMSF כדי למנוע פירוק חלבונים.

כעת בצעו סוניקציה לתרחיף התאים באמצעות שבעה פולסים של שנייה אחת בכל פולס, תוך שימוש בסוניקטור עם פרוב של 2 mm. השתמשו ב-hemocytometer כדי לוודא כי למעלה מ-90% מהתאים עברו דיסרופציה.

בשלב הבא, סבב את התערובת בצנטריפוגה במהירות של 14,000 RPM בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. העבר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) לשפופרת safe lock בנפח של שני מיליליטר, וקבע את ריכוז החלבון עבור כל הזרקה בשיטות סטנדרטיות. חלק לשבע מנות של 10⁶ PBMCs לשני מיליליטר.

מבובות מסוג Safe lock ירוספו את התאים באמצעות סרצ'יפוגציה. ראשית, הכין תרחיף של ביקורת שלילית של PBMC ב-35 µL של PBS. לאחר מכן, עבור ביקורת חיובית, הוסף 25 µL של אנטיגן זיכרון, tetanus toxoid, diphtheria toxoid, והשלם את נפח ההזרקה ל-35 µL באמצעות PBS.

בהתאם למערך הניסוי להערכת תגובה ספציפית לתורם, השהו שוב את משקע התאים ב-10 µL של אנטיגן תורם בתוספת 25 µL של PBS, לנפח כולל של 35 µL. להערכת ויסות ספציפי לאנטיגן תורם ניסויי, השהו שוב את משקע התאים ב-35 µL על ידי הוספת 10 µL של אנטיגן תורם ו-25 µL של אנטיגן recall TT DT. לאחר הרדמה של עכבר ה-skid באמצעות isof fluorine, מקמו קליפר בעל קפיץ במרכז כרית כף הרגל, כאשר קצה אחד נוגע בכרית ההליכה האחרונה של כף הרגל כדי לספק נקודת ייחוס לשמירה על עקביות של אתר המדידה כאשר קריאת המד התייצבה.

רשמו את עובי כרית כף הרגל הבסיסי לצורך ההזרקה לכרית כף הרגל. מקמו את המזרק כך שהמחט פונה לכיוון הבהונות והחיתוך פונה כלפי מעלה. כעת התחילו בהזרקות תת-עוריות של כל תרחיף תאים לכריות כף הרגל האחוריות של העכבר.

שלב ראשון, הזרק באיטיות לכרית כף רגל ימין את תמיסת ביקרת השלילה. לאחר מכן, הזרק לכרית כף רגל שמאל את ביקרת החיובי של PBMC פלוס TT dt. כעת החזר את העכבר לכלובו.

שנית, הזרקו לכרית כף הרגל הימנית PBMC בתוספת allo antigen ואלכרית כף הרגל השמאלית PBMC בתוספת allo antigen ובתוספת TT dt. ודאו שאין דליפה כ-18 עד 24 שעות לאחר ההזרקה. הרדימו כל עכבר באמצעות isof fluorine וחזרו על מדידת הנפיחות של כרית כף הרגל.

חסרו את עובי כל כרית כף הרגל לפני ההזרקה מהערך לאחר ההזרקה כדי לקבל את ערך הנפיחות של כרית כף הרגל. לאחר מכן, חשבו את הנפיחות נטו הספציפית לאנטיגן על ידי חיסור ערך הנפיחות של כרית כף הרגל בביקורת מערך הנפיחות של כרית כף הרגל שהתקבל מהטיפולים. ודאו כי קריאת ביקורת החיובי מראה תגובה חיובית לאנטיגן זיכרון TT DT של 25 times 10⁻⁴ inches ומעלה.

נדרשת תגובת רקע ל-PBS כדי שהבדיקה תיחשב לתקינה. לאחר מכן, קבע את העכבה של תגובות הזיכרון בנוכחות אנטיגנים של תורם. ניסוי זה מעריך מקבלי השתלות כליה עבור תגובה ספציפית לאנטיגנים של התורם ועבור רגולציה.

קיימים שלושה דפוסים עיקריים של רגישות מאחרת (delayed type hypersensitivity) במקבלי השתלה: רגולטורי, לא-רגולטורי ורגיש (sensitized). כל המטופלים הגיבו בעוצמה לבקרת החיוביות של אנטיגן זיכרון (recall antigen) tt. מטופל מספר 62 מראה את הדפוס הרגולטורי, המאופיין בתגובה חלשה לאנטיגן התורם ובדיכוי מקושר בולט של התגובה לאנטיגן הזיכרון בנוכחות אנטיגן התורם.

זוהי התבנית שנמצאה כקשורה לסבילות לש transplantation של איברים. מטופל מספר 48 מראה תבנית שאינה רגולטורית, המאופיינת בתגובה חלשה לתורם, אך ללא דיכוי מקושר. תבנית זו נצפתה לעיתים קרובות במטופלים הנוטלים תרופות אימונוסופרסיביות.

מטופל מספר שמונה מציג דפוס של רגישות לתורם, המאופיין בתגובה גבוהה לאנטיגן של התורם וללא דיכוי מקושר. תגובה זו קשורה לדחיית השתל. במחקרי מקרה קליניים, נבדקו BMCs של מטופלים שהשתתפו בניסוי תצפיתי כדי לבחון תגובות של מסלול עקיף ספציפי לתורם, תאי T אפקטוריים ותאי T רגולטוריים, וזאת במטרה להעריך את תפקידה של הרגולציה הספציפית לתורם בסבילות קלינית.

התגובות העקיפות של תאי T לאנטיגנים של התורם חושפות ספקטרום מובחן בין קבוצות הגיוס. הנפיחות בכרית כף הרגל עולה ככל שהמצב הקליני של המטופל עובר מאלו שהם טולרנטיים לאלו הסובלים מדחייה כרונית. כאן, בדיקת הדיכוי המקושרת מודדת את נתיב התגובה העקיפה של תאי T רגולטוריים נגד התורם.

נתונים אלה מראים ירידה בתגובות הרגולטוריות בטווח שבין המטופלים הסובלניים ביותר, דרך מטופלים ברמה בינונית, ועד למטופלים עם דחייה כרונית הפחות סובלניים. יחד, נראה כי ויסות חיסוני, כפי שנמדד באמצעות בדיקת DTH trans vivo, מהווה מנגנון חשוב לקבלת השתלת כליה.

תחום מבטיח הוא יישום בדיקת ה-TDTH לניטור של אוטואימוניות. המחקר שלנו על תפקידו של קולגן מסוג חמישה בתהליך הפתולוגי של תסמונת bronchiolitis OBL גילה כי הסיכון היחסי הגבוה ביותר להתפתחות BOS נצפה בחולים שהפגינו תגובה חיובית לקולגן חמישה ב-pbmc של נקבלי השתלת ריאה, אך לא בקבוצות ביקורת בריאות או לקולגן.

ארבעה חולים עם תסמונת מרעה טובה (good pasture syndrome) שהגיבו לבדיקה לאחר השתלת כליה הראו תגובתיות תכופה לקולגן חמישי. ניתן להשתמש בבדיקת TDTH גם כדי לבחון את התגובתיות של pbmc מחולי סרטן לאנטיגנים ספציפיים לגידול. לדוגמה, נוכחותן של תאי T רגולטוריים ספציפיים ל-PAP בחולי סרטן הערמונית עשויה להגביל את התגובה לחיסון באנטיגן PAP.

בדיקת ה-TRANSVAAL DTH היא מבחן אבחנתי חדשני עם יישום קליני להערכת תגובות חיסוניות תיווכות-תאים בחולי השתלות, סרטן ומחלות אוטואימוניות. היא בעלת ערב רב כיוון שהיא אינה שימושית רק בניטור תגובות זיכרון של תאי T אפקטורים, אלא יכולה לשמש גם לגילוי תגובות של תאי T רגולטוריים, מכיוון שאינה מסתמכת על מדידה של ציטוקין מסוים לצורך זיהוי תאי T אפקטורים או רגולטוריים. הבדיקה גמישה מאוד וניתנת ליישום רחב.