ניתוח של תפקוד גן ויזואליזציה של זרימת נוזל צילה שנוצרה בשלפוחיות של Kupffer

מטרת הליך זה היא לווסת את הגנים התפקודיים בשלפוחית Kavas או ב-KV בעובר דג הזברה האחראי על דפוס שמאל ימין ולנתח זרימת נוזל אסימטרית הנוצרת על ידי מוטיל clia על ידי העברת חרוזים פלואורסצנטיים לתוך ה-kv. זה מושג על ידי הזרקה ראשונה של אוליגונוקלאוטידים פלואורסצנטיים המדכאים ביטוי של גן ספציפי מעניין בתא החלמון של עובר בשלב דילה באמצע הפלאש, כך שהם נטענים לתאים מבשרים גביים היוצרים את ה-kv. לאחר מכן, עוברים מוזרקים שיש להם מורפוס פלואורסצנטי רק בתא החלמון וב-kv נבחרים לניתוח נוסף.

לאחר מכן העוברים מותקנים במגלשות שקע וחרוזים פלואורסצנטיים מוזרקים ללומן השלפוחית המלא בנוזל של ה-kv. לבסוף, מיקרוסקופ וידאו משמש להקלטת חרוזים הזורמים בתוך ה- kv. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות הקובעות אם דלדול ספציפי לרקמה של גן מועמד ב-KV משנה את זרימת הנוזל הא-סימטרי באמצעות ניתוח כמותי של תנועות חרוזים.

הדגמה ויראלית של סמסטר זה היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד זריקות מולינו ספציפיות לשלב והזרקות חרוזים פלואורסצנטיות מכיוון ששתיהן תלויות בהצעת העובר ובתזמון ההתפתחותי של הניסוי. כדי לבצע זריקות מורף גלובליות או MO, אסוף עוברים מיד לאחר ההפריה והעמיס אותם לתוך צלחת הזרקה. השתמש באש מלוטשת מעבר לפיפטה שלנו כדי למקם את העוברים בצלחת ההזרקה כדי לשתק את העוברים.

שברו את קצה מחט ההזרקה והתאימו את הגדרות ההזרקה ליצירת טיפת הזרקה בנפח של ננוליטר אחד. באמצעות מיקרוסקופ מנתח, הזרקו ננוליטר אחד של MO לעול של לפחות 50 עוברים בין שלב התא האחד לארבעה. עבור הזרקת M mo ממוקדת DFC אוספים עוברים מיד לאחר ההפריה ודוגרים ב-28.5 מעלות צלזיוס.

כאשר העוברים מגיעים לשלב 256 התאים, טען אותם במהירות לתוך צלחת הזרקה והזריק ננוליטר אחד של MO פלואורסצנטי לחלמון. להזריק לפחות 100 עוברים בין 256 ל-1000 שלבי התאים כדי לבצע הזרקה ממוקדת חלמון. לאחר הדגירה של ביציות מופרות לשלב הכיפה, יש להזריק ננוליטר אחד של MO פלואורסצנטי בעול של לפחות 100 עוברים בין הכיפה ל-30% מהשכבות.

כאשר העוברים המוזרקים מגיעים ל-75% לשלב השכבה. הסר עוברים לא מופרים ומתים תחת מיקרוסקופ מנתח להזרקות MO גלובליות. בחר עוברים חיים לפלואורסצנטיות המפוזרים באופן שווה בכל התאים.

עבור זריקות M mo ממוקדות DFC, בחר עוברים עם פלואורסצנטיות מפוזרות לאורך החלמון ומרוכזות בשולי העור המפוצצים בגב. לזריקות MO ממוקדות חלמון. בחר עוברים שבהם הקרינה מפוזרת באופן שווה בכל החלמון ואינה נצפית בתאים עובריים בין שניים לארבעה.

אז שלבי קרדית. בחר עוברים ממוקדי DFC המציגים פלואורסצנטיות רק בתאי KV ובחלמון והשליכו את השאר להזרקות ממוקדות חלמון. בחר עוברים עם פלואורסצנטיות אך ורק בחלמון כדי לנתח זרימה אסימטרית ב-KV של MO עוברים מוזרקים מתחילים בשימוש במלקחיים חדים כדי לצפות בזהירות כ-20 עוברים בין הארבעה לשישה.

כך ששלבים עשויים להעביר עובר אחד למגלשת שקע זכוכית ולהוציא כמה שיותר מים. קבעו את העובר על ידי הוספת מספיק אירו נקודת התכה נמוכה חמה של 1% כדי לכסות אותו בזמן שהאווירו מתמצק. השתמש במלקחיים כדי למקם אותו כך שה-KV פונה כלפי מעלה, הרכיב 10 עוברים הפועלים במהירות כדי להבטיח שכל ההזרקות יושלמו עד ה-10.

אז שלב הקרדית. לאחר דילול מיקרו חרוזים פלואורסצנטיים בקוטר 0.5 מיקרון לאחד עד 50 במים סטריליים. מערבבים היטב את החרוזים וטוענים שלושה מיקרוליטר למחט נימית באמצעות אותו מזרק מיקרו המשמש להזרקות MO.

השתמש במלקחיים כדי לשבור את קצה המחט והתאם את הגדרות ההזרקה כדי ליצור את ההזרקה הקטנה ביותר האפשרית. טיפה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח, יישר את המחט עם לומן ה- KV של העובר המותקן הראשון. לאחר מכן הכנס את המחט ללומן והזריק פחות מ-0.5 ננוליטר חרוזים.

הוסף טיפת מים סטריליים על הארוס כדי למנוע מהעובר להתייבש תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף. באמצעות סינון אובייקטיבי של פי 20 העוברים המוזרקים למסירה מוצלחת של חרוזים לכל עובר נבחר עם חרוזים בתוך ה-KV בטיפת מים סטריליים כדי לכסות את הארוס. לאחר מכן התבונן באמצעות מיקרוסקופ תרכובת פלואורסצנטי עם יעד טבילה במים פי 63.

באמצעות מצלמה מהירה המותקנת על המיקרוסקופ הקליטו סרט של עשר שניות. השתמש בערוץ הפלואורסצנטי כדי להקליט את החרוזים בכ-70 פריימים לשנייה וניגודיות של שדה בהיר או הפרעות דיפרנציאליות כדי להקליט את לומן ה-KV. ייבא את הסרטים לתמונה J.צור הקרנות מקסימליות והשתמש בתוכנה כדי לעקוב אחר תנועות החרוזים הבודדים.

איור זה מציג את התפלגות ה-MO הפלואורסצנטי בעוברים מוזרקים חיים ספציפיים לשלב מוצלח. הזרקת MO לא מוצלחת שבה התמיסה נשארת מצטברת בתא החלמון מוצגת כאן. ניתן למדוד את זרימת הנוזלים בעוברים שהוזרקו בהצלחה באופן איכותי או כמותי בעובר ביקורת עם חרוזי זרימה תקינה.

עקוב אחר נתיבים נגד כיוון השעון שניתן לדמיין על ידי ביצוע הקרנה מקסימלית של מיקומי חרוזים פלואורסצנטיים לאורך זמן או על ידי מעקב אחר חרוזים בודדים לאורך זמן. כדי להדגים אובדן זרימה מתואמת הוזרקו לעוברים MO כדי לפרק קינאז שורה 2 B או סלע 2 B, מה שמשבש את הזרימה, וכתוצאה מכך, החרוזים נעים באופן אקראי ב-kv, המהירות הממוצעת של חמישה חרוזים מבקרה וסלע שני עוברי B mo מוצגת כאן לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לחקור גנים ומנגנונים בביסוס גישה לגוף ימין שמאלי בדג זברה.